Генерация мышей-нокаутов, специфичных для бурого жира, с использованием комбинированной системы однонаправленной РНК Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированной вирусной РНК
Summary
В этом протоколе мы описываем технические процедуры для создания мышей-нокаутов, специфичных для бурой жировой ткани (BAT), с использованием комбинированной системы однонаправляющей РНК (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированного вируса (AAV). Описанные этапы включают проектирование сгРНК, подготовку частиц AAV-sgRNA и микроинъекцию AAV в доли BAT.
Abstract
Бурая жировая ткань (BAT) представляет собой жировое депо, специализирующееся на рассеивании энергии, которое также может служить эндокринным органом посредством секреции биологически активных молекул. Создание BAT-специфических нокаут-мышей является одним из самых популярных подходов к пониманию вклада интересующего гена в BAT-опосредованную регуляцию энергии. Традиционная стратегия нацеливания на гены с использованием системы Cre-LoxP была основным подходом к созданию ткано-специфических нокаутных мышей. Однако такой подход отнимает много времени и утомителен. Здесь мы описываем протокол быстрого и эффективного нокаута интересующего гена в BAT с использованием комбинированной системы однонаправляющей РНК (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и аденоассоциированного вируса (AAV). Межлопаточная БАТ расположена в глубоком слое между мышцами. Таким образом, BAT должен быть выставлен, чтобы точно и непосредственно вводить AAV в BAT в поле зрения. Надлежащая хирургическая обработка имеет решающее значение для предотвращения повреждения симпатических нервов и сосудов, таких как вена Зульцера, которая соединяется с БАТ. Чтобы свести к минимуму повреждение тканей, существует острая необходимость в понимании трехмерного анатомического расположения НДТ и хирургических навыков, необходимых на технических этапах. В этом протоколе освещаются ключевые технические процедуры, включая разработку сгРНК, нацеленных на интересующий ген, подготовку частиц AAV-sgRNA и операцию по прямой микроинъекции AAV в обе доли BAT для получения BAT-специфических нокаутных мышей, которые могут быть широко применены для изучения биологических функций генов в BAT.
Introduction
Ожирение растет значительными темпами во всем мире, что приводит к широкому спектру метаболических заболеваний 1,2,3. Жировая ткань является ключом к этим патологиям. Существуют два функционально различных типа жировой ткани: белая жировая ткань (WAT), которая хранит лишние калории, и коричневая жировая ткань (BAT) и связанный с ней бежевый / бритовый жир, которые рассеивают энергию для термогенеза. В то время как BAT был признан за его рассеивающую энергию функцию, он также выполняет эндокринные функции за счет производства биологически активных молекул, которые регулируют метаболизм в дистальных органах 4,5. Многочисленные исследования на грызунах показали, что увеличение количества или активности бурого или бежевого жира приводит к увеличению расхода энергии и улучшению чувствительности к инсулину. У людей с выявляемой НДТ распространенность кардиометаболическихзаболеваний значительно ниже6. Таким образом, BAT обладает отличным терапевтическим потенциалом в отношении метаболических последствий, связанных с ожирением 7,8,9.
Для исследования физиологии и патофизиологии развития и функционирования БАТ и выяснения молекулярных механизмов, участвующих в этих процессах, методом выбора является модель трансгенных мышей, специфичная для BAT,10. Система рекомбинации Cre-LoxP является наиболее часто используемым средством для получения мышей с условным нокаутом путем редактирования генома мыши. Эта система позволила модифицировать (сверхэкспрессию или нокаут) интересующих генов тканеспецифическим образом11. Он также может быть использован для маркировки определенного типа клеток путем экспрессии селективного флуоресцентного репортерного гена.
В последнее время системный подход Cre-LoxP получил дальнейшее развитие путем объединения технологии CRISPR-Cas9 и системы аденоассоциированного вируса (AAV) с одной направляющей РНК (sgRNA)12. Система CRISPR-Cas9 представляет собой специфический и эффективный инструмент редактирования генов для модификации, регулирования или нацеливания на точные области генома13. Редактирование генома на основе CRISPR-Cas9 позволяет быстро генетически манипулировать геномными локусами, поскольку не требует гомологичной рекомбинации с вектором, нацеленным на гены. Комбинированные методы Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и AAV-sgRNA позволяют исследователям более точно понимать функции генов, позволяя исследовать роль интересующих генов в желаемое время в тканях / клетках. Кроме того, эти комбинированные методы сокращают время и усилия, необходимые для создания трансгенных мышей, и позволяют контролировать временную активность CRISPR-Cas9 для индуцируемого редактирования генома у мышей, если используется индуцируемая линия Cre14.
Векторы AAV безопасны и эффективны в системах доставки генов in vivo. Однако AAV, нацеленные на жировую ткань, отстают от применения в других тканях, таких как мозг, сердце, печень и мышцы15. Из-за относительно низкой эффективности трансдукции и тропизма с естественными векторами серотипа доставка генов под контролем AAV в жировую ткань по-прежнему является сложнойзадачей 15. За последние 5 лет мы и другие успешно установили эффективные и минимально инвазивные способы доставки генов, управляемых AAV, в жировую ткань и создали мышиные модели, которые позволяют нам получить представление о генах, участвующих в регуляции функции BAT16,17,18,19. Например, используя AAV8 для доставки сгРНК, нацеленной на Alox12, которая кодирует 12-липоксигеназу (12-LOX), в BAT мышей Ucp1-Cre / Cas9, мы обнаружили, что активированный BAT продуцирует метаболиты 12-LOX, а именно 12-гидрокси-эйкозапентаеновую кислоту (12-HEPE) и 13R, 14S-дигидроксидокозагексаеновую кислоту (марезин 2), для регулирования метаболизма глюкозы и устранения воспаления, связанного с ожирением, соответственно16, 17. Здесь мы приводим пошаговый протокол технических процедур, в частности операции по прямой микроинъекции AAV-sgRNA в доли BAT, для создания BAT-специфических нокаутных мышей с использованием комбинированной системы Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 и AAV-sgRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существующие опубликованные методы доставки генов, опосредованных AAV, в межлопаточную БАТ не содержат подробных фотографий и видео, описывающих хирургические методы и подход к прямому введению ААВ в БАТ. В большинстве опубликованных методов33,34 AAV вводят в жировые ткани,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения США (NIH) R01DK122808, R01DK102898 и R01DK132469 (для Y.-H.T.), а также P30DK036836 (для Центра исследований диабета Джослина). Т. Т. был поддержан исследовательской стипендией SUNSTAR (стипендия Хироо Канеда, Фонд Sunstar, Япония) и грантом Американской кардиологической ассоциации 903968. Ю. З. был поддержан стипендией Фонда Чарльза А. Кинга. Мы благодарим Шона Д. Кодани за любезную корректуру рукописи.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer’s disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
