Generering av brune fettspesifikke knockoutmus ved bruk av et kombinert Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 og adenoassosiert virus enkeltveis RNA-system
Summary
I denne protokollen beskriver vi de tekniske prosedyrene for å generere brunt fettvev (BAT)-spesifikke knockoutmus som utnytter et kombinert Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 og adenoassosiert virus (AAV) enkeltveis RNA (sgRNA) system. De beskrevne trinnene inkluderer utformingen av sgRNAene, fremstillingen av AAV-sgRNA-partiklene og mikroinjeksjon av AAV i BAT-.
Abstract
Brunt fettvev (BAT) er et fettdepot spesialisert på energispredning som også kan tjene som et endokrint organ via sekresjon av bioaktive molekyler. Opprettelsen av BAT-spesifikke knockoutmus er en av de mest populære tilnærmingene for å forstå bidraget fra et gen av interesse for BAT-mediert energiregulering. Den konvensjonelle genmålrettingsstrategien som bruker Cre-LoxP-systemet har vært den viktigste tilnærmingen for å generere vevsspesifikke knockoutmus. Denne tilnærmingen er imidlertid tidkrevende og kjedelig. Her beskriver vi en protokoll for rask og effektiv knockout av et gen av interesse for BAT ved bruk av et kombinert Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 og adenoassosiert virus (AAV) enkeltveis RNA (sgRNA) system. Den interscapulære BAT ligger i det dype laget mellom musklene. BAT må derfor eksponeres for å injisere AAV nøyaktig og direkte inn i BAT innenfor synsfeltet. Riktig kirurgisk håndtering er avgjørende for å forhindre skade på sympatiske nerver og kar, for eksempel Sultzers vene som kobles til BAT. For å minimere vevskader er det et kritisk behov for å forstå den tredimensjonale anatomiske plasseringen av BAT og de kirurgiske ferdighetene som kreves i de tekniske trinnene. Denne protokollen fremhever de viktigste tekniske prosedyrene, inkludert utformingen av sgRNA rettet mot genet av interesse, fremstilling av AAV-sgRNA-partikler og kirurgi for direkte mikroinjeksjon av AAV i begge BAT-lober for å generere BAT-spesifikke knockoutmus, som bredt kan brukes til å studere de biologiske funksjonene til gener i BAT.
Introduction
Fedme øker med en betydelig hastighet over hele verden, noe som fører til et bredt spekter av metabolske sykdommer 1,2,3. Fettvevet er nøkkelen til disse patologiene. De to funksjonelt distinkte typer fettvev som finnes er hvitt fettvev (WAT), som lagrer overflødige kalorier, og brunt fettvev (BAT) og dets relaterte beige / brite fett, som sprer energi for termogenese. Mens BAT har blitt anerkjent for sin energiavledende funksjon, har den også endokrine funksjoner via produksjon av bioaktive molekyler som regulerer metabolisme i distale organer 4,5. Tallrike studier hos gnagere har vist at økt mengde eller aktivitet av brunt eller beige fett fører til økt energiforbruk og forbedret insulinfølsomhet. Hos mennesker har personer med påviselig BAT en betydelig lavere forekomst av kardiometabolske sykdommer6. BAT har således et utmerket terapeutisk potensial for fedmerelaterte metabolske følgetilstander 7,8,9.
For å undersøke fysiologien og patofysiologien til BATs utvikling og funksjon og for å belyse de molekylære mekanismene som er involvert i disse prosessene, er den BAT-spesifikke transgene musemodellen en metode for valg10. Cre-LoxP-rekombinasjonssystemet er den mest brukte måten å produsere betingede knockoutmus ved å redigere musegenomet. Dette systemet har muliggjort modifisering (overekspresjon eller knockout) av gener av interesse på en vevs-/cellespesifikk måte11. Det kan også brukes til å merke en bestemt celletype ved å uttrykke et selektivt fluorescerende reportergen.
Nylig har Cre-LoxP-systemtilnærmingen blitt videreutviklet ved å kombinere CRISPR-Cas9-teknologien og adeno-associated virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system12. CRISPR-Cas9-systemet er et spesifikt og effektivt genredigeringsverktøy for å modifisere, regulere eller målrette mot presise regioner av genomet13. CRISPR-Cas9-basert genomredigering muliggjør rask genetisk manipulering av genomiske loci fordi det ikke krever homolog rekombinasjon med en genmålrettingsvektor. Kombinerte Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og AAV-sgRNA-teknikker gjør det mulig for forskere å forstå genfunksjoner mer presist ved å tillate undersøkelse av rollen til gener av interesse på ønskede tidspunkter i vev / celler. I tillegg reduserer disse kombinerte teknikkene tiden og kreftene som kreves for å generere transgene mus og tillater tidsmessig kontroll av CRISPR-Cas9-aktivitet for induserbar genomredigering hos mus hvis en induserbar Cre-linje brukes14.
AAV-vektorer er trygge og effektive in vivo genleveringssystemer. AAV-er rettet mot fettvev har imidlertid ligget etter applikasjoner i andre vev, som hjerne, hjerte, lever og muskel15. På grunn av relativt lav transduksjonseffektivitet og tropisme med naturlig forekommende serotypevektorer, er AAV-veiledet genlevering til fettvev fortsatt utfordrende15. I løpet av de siste 5 årene har vi og andre lykkes med å etablere effektive og minimalt invasive måter å levere AAV-guidede gener inn i fettvev og laget musemodeller som lar oss få en forståelse av genene som er involvert i reguleringen av BAT-funksjonen16,17,18,19. For eksempel, ved å bruke AAV8 til å levere sgRNA rettet mot Alox12, som koder for 12-lipoksygenase (12-LOX), inn i BAT av Ucp1-Cre / Cas9-musene, har vi oppdaget at aktivert BAT produserer 12-LOX-metabolitter, nemlig 12-hydroksy-eikosapentaensyre (12-HEPE) og 13R, 14S-dihydroksydokosaheksaensyre (maresin 2), for å regulere glukosemetabolismen og løse fedme-assosiert betennelse, henholdsvis16, 17. Her gir vi en trinnvis protokoll om de tekniske prosedyrene, spesielt kirurgi for direkte mikroinjeksjon av AAV-sgRNA i BAT-, for å generere BAT-spesifikke knockoutmus ved bruk av det kombinerte Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og AAV-sgRNA-systemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
De eksisterende publiserte metodene for AAV-mediert genlevering til interskapulær BAT inneholder ikke detaljerte bilder og videoer som beskriver operasjonsteknikker og tilnærming for direkte AAV-injeksjon i BAT. I de fleste av de publiserte metodene33,34 injiseres AAV i fettvevet rundt den interskapulære BAT i stedet for selve BAT. Derfor er det flere viktige trinn i denne protokollen som bestemmer suksessen til studien. Disse inkluderer utformingen av sgRNA, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet delvis av US National Institutes of Health (NIH) tilskudd R01DK122808, R01DK102898 og R01DK132469 (til Y.-H.T.), samt P30DK036836 (til Joslin Diabetes Center’s Diabetes Research Center). TT ble støttet av SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japan) og American Heart Association grant 903968. Y. Z. ble støttet av Charles A. King Trust Fellowship. Vi takker Sean D. Kodani for korrekturlesing av manuskriptet.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer’s disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
