La función del músculo esquelético se puede evaluar cuantificando la contractilidad de las fibras musculares aisladas, tradicionalmente utilizando enfoques laboriosos y de bajo rendimiento. Aquí, describimos un método de alto rendimiento basado en la óptica para cuantificar la contractilidad de las fibras musculares incrustadas en hidrogel. Este enfoque tiene aplicaciones para la detección de fármacos y el desarrollo terapéutico.
El cultivo celular in vitro es una herramienta poderosa para evaluar los procesos celulares y probar estrategias terapéuticas. Para el músculo esquelético, los enfoques más comunes implican diferenciar las células progenitoras miogénicas en miotubos inmaduros o el cultivo ex vivo a corto plazo de fibras musculares individuales aisladas. Un beneficio clave del cultivo ex vivo in vitro es la retención de la compleja arquitectura celular y las características contráctiles. Aquí, detallamos un protocolo experimental para el aislamiento de fibras musculares flexoras digitorum brevis intactas de ratones y su posterior cultivo ex vivo . En este protocolo, las fibras musculares están incrustadas en un hidrogel de matriz de membrana basal y a base de fibrina para inmovilizar las fibras y mantener su función contráctil. Luego describimos métodos para evaluar la función contráctil de la fibra muscular utilizando un sistema de contractilidad de alto rendimiento basado en óptica. Las fibras musculares incrustadas se estimulan eléctricamente para inducir contracciones, después de lo cual sus propiedades funcionales, como el acortamiento del sarcómero y la velocidad contráctil, se evalúan utilizando cuantificación basada en la óptica. El acoplamiento del cultivo de fibras musculares con este sistema permite realizar pruebas de alto rendimiento de los efectos de los agentes farmacológicos sobre la función contráctil y estudios ex vivo de trastornos musculares genéticos. Finalmente, este protocolo también se puede adaptar para estudiar procesos celulares dinámicos en fibras musculares utilizando microscopía de células vivas.
Los avances en las técnicas de cultivo celular in vitro han abierto nuevas posibilidades para estudiar las capacidades regenerativas de los tejidos, los mecanismos celulares fisiopatológicos y las estrategias terapéuticas posteriores, todo ello utilizando tejidos de mamíferos en condiciones bien controladas 1,2,3. El uso de sistemas de cultivo in vitro está bien establecido dentro del campo de la investigación muscular 4,5. En general, se utilizan miotubos inmaduros diferenciados in vitro a partir de células progenitoras miogénicas 2,6,7,8. Aunque se ha avanzado en el protocolo de diferenciación para generar fibras musculares más maduras9, su inmadurez aún limita la traducción de los hallazgos a un ajuste in vivo 1,10. Un tema central en el campo de la biología muscular es la incapacidad de los miotubos diferenciados in vitro para personificar completamente las complejas estructuras intracelulares, los procesos de señalización celular y las interacciones extracelulares observadas en el tejido muscular nativo y, lo que es más importante, recapitular las fuerzas contráctiles producidas por las fibras musculares 1,2,10,11,12 . Además, la contracción descoordinada de los miotubos durante el proceso de diferenciación a menudo resulta en un desprendimiento espontáneo de las placas de cultivo, lo que hace que la evaluación contráctil de los miotubos diferenciados in vitro sea desafiante y restringida a la evaluación cualitativa o semicuantitativa 8,11,12,13. Estas limitaciones a menudo requieren experimentos regulares in vivo con animales, particularmente si la contractilidad muscular es un resultado experimental primario1.
Una alternativa al cultivo in vitro diferenciado es el cultivo ex vivo de fibras musculares maduras aisladas 1,14. Durante el cultivo ex vivo, el tejido muscular maduro en desarrollo se extirpa del cuerpo, seguido de aislamiento unicelular para el cultivo en condiciones de laboratorio 1,14. Las fibras musculares maduras aisladas mantienen sus complejas estructuras celulares observadas dentro del tejido nativo14,15, y este método abre la posibilidad de intervenciones directas, como la manipulación genética y el tamizaje de drogas, en un ambiente de cultivo bien definido y controlable. Uno de los primeros informes sobre el aislamiento de la fibra muscular esquelética y el cultivo ex vivo se remonta a la década de 1930; Sin embargo, el rendimiento de fibras viables de este protocolo fue bajo16. Con la optimización continua del procedimiento de aislamiento y las condiciones de cultivo, ahora es posible una mejora significativa en la cantidad de fibras musculares viables y funcionales 14,15,17,18,19. Una de esas mejoras en las condiciones de cultivo consiste en recubrir las placas de cultivo con proteínas de matriz extracelular para promover la adhesión de las fibras musculares aisladas en la placa de cultivo15,18,20. Por lo general, se utiliza el recubrimiento de laminina, ya que la laminina es uno de los elementos más abundantes dentro de la matriz extracelular de los músculos20,21. La optimización del procedimiento de aislamiento combinada con el recubrimiento de las placas de cultivo han permitido al campo de investigación muscular mantener fibras musculares viables aisladas con arquitectura celular intacta y funcionalidad contráctil en cultivo por cortos períodos de tiempo 1,15,18,22.
El enfoque más convencional utilizado dentro del campo muscular para medir la fuerza y las capacidades contráctiles es montar fibras musculares individuales entre un motor conductor de longitud y un transductor de fuerza23,24. En general, las fibras musculares utilizadas para estas configuraciones motoras se diseccionan a partir de tejido fresco o ultracongelado, seguido de permeabilización o “despellejamiento”, lo que permite la activación externa del calcio, donde se utilizan concentraciones variables de calcio para inducir la contracción de la fibra muscular24. Si bien este método es el estándar de oro para las mediciones contráctiles de fibras musculares, solo se puede medir una fibra muscular a la vez, lo que hace que esta técnica sea un procedimiento laborioso y lento25. Además, el procedimiento de aislamiento y desollamiento de las fibras musculares interrumpe las diversas estructuras involucradas en el acoplamiento excitación-contracción (es decir, la liberación de calcio y la posterior recaptación en el retículo sarcoplásmico), lo que no permite el estudio de la cinética de relajación y cualquier enfermedad que pueda afectar este proceso26,27. Una alternativa a la preparación de fibras peladas es el uso de disección mecánica para aislar fibras musculares intactas, donde las fuerzas contráctiles pueden ser medidas en respuesta a la activación eléctrica28; Sin embargo, este enfoque es técnicamente desafiante y requiere mucho tiempo, lo que resulta en mediciones de bajo rendimiento. Por último, tanto en preparaciones peladas como intactas, las células musculares son completamente eliminadas del ambiente extracelular durante las mediciones contráctiles 24, haciendo imposible la investigación del efecto de la composición/rigidez de la matriz extracelular sobre la contracción de la fibra muscular24. Como resultado, se necesita el desarrollo de métodos alternativos para permitir mediciones de contractilidad de fibras musculares intactas aisladas de una manera de alto rendimiento mientras se recrea la conexión entre las fibras musculares y la matriz extracelular.
Recientemente, se desarrolló un nuevo enfoque basado en la óptica para mediciones de contractilidad de fibras musculares de alto rendimiento29. Este sistema basado en óptica mide la periodicidad de los sarcómeros para evaluar la longitud del sarcómero durante la contracción utilizando imágenes de alta velocidad. Dentro de este sistema, las células permanecen en su lugar en la placa de cultivo mientras se mueve la óptica, minimizando así el tiempo necesario entre las mediciones de múltiples células29. Una ventaja importante de utilizar este enfoque de alto rendimiento basado en la óptica es que permite desarrollar condiciones de cultivo similares a las del tejido nativo. Un enfoque utilizado para imitar las condiciones nativas in vivo es incrustar células en hidrogeles30. Típicamente, un hidrogel es un material viscoelástico capaz de mantener su volumen y forma, y los hidrogeles tienen las propiedades de los materiales sólidos y líquidos31. La parte sólida consiste en cadenas de polímero entrelazadas entre sí, creando una estructura que se parece a un30,31 neto. Las propiedades materiales de los hidrogeles se pueden ajustar para imitar la deposición de la matriz de los músculos30,31. Por lo tanto, la combinación de un sistema de alto rendimiento basado en la óptica con células incrustadas en hidrogeles abre nuevas posibilidades para evaluar los efectos de la composición de la matriz extracelular y las propiedades mecánicas en la funcionalidad de la fibra muscular.
El objetivo general de este trabajo es 1) describir la metodología para el aislamiento enzimático y el cultivo ex vivo de fibras musculares en condiciones que imitan el entorno tisular nativo y 2) evaluar la contractilidad de la fibra muscular utilizando un enfoque de alto rendimiento. Describimos una metodología detallada para aislar fácilmente un gran número de fibras musculares individuales del músculo flexor digitorum brevis (FDB) utilizando la digestión enzimática. Además, describimos una técnica para incrustar las fibras musculares aisladas en un hidrogel a base de fibrina con el fin de imitar el entorno nativo de los músculos y mejorar la viabilidad y contractilidad de la fibra muscular. Luego describimos un método de alto rendimiento para medir las contracciones de fibras musculares vivas in vitro utilizando este sistema recientemente desarrollado. Una ventaja adicional de este procedimiento de incrustación es la inmovilización de fibras durante la contracción, lo que puede mejorar la relación señal-ruido de estas mediciones. Este método de incrustación en gel es aplicable tanto para procedimientos de encapsulación de polímero único como de gel compuesto, lo que facilita la evaluación de los efectos de la composición de la matriz extracelular en la contractilidad de la fibra muscular.
Aquí, detallamos un protocolo para realizar el aislamiento enzimático y el cultivo de fibras musculares FDB en un formato de cultivo 3D, seguido de mediciones contráctiles utilizando un sistema de medición contráctil basado en óptica. Este protocolo tiene una serie de ventajas, incluyendo el 1) aislamiento directo y oportuno de muchas fibras musculares intactas de un solo músculo; 2) la incrustación de las fibras musculares en una matriz de hidrogel sintonizable; 3) la realización de mediciones de contractilidad de alto rendimiento utilizando el sistema basado en óptica; y 4) la capacidad de realizar mediciones repetidas de las mismas fibras musculares después de una intervención. El aislamiento de fibras musculares vivas individuales proporciona células musculares maduras que conservan su función contráctil. Como las fibras musculares obtenidas de la FDB de ratón son relativamente pequeñas, se manipulan fácilmente durante el aislamiento y mantienen su forma recta, lo que permite mediciones contráctiles aguas abajo. Aunque el sistema fue desarrollado principalmente para estudiar la contracción de los cardiomiocitos, las fibras musculares esqueléticas contienen la misma maquinaria contráctil con patrones de sarcómero fácilmente distinguibles y, por lo tanto, también pueden medirse utilizando este sistema29. El acoplamiento de mediciones contráctiles unicelulares con cultivo de fibra muscular ex vivo vivo es una herramienta poderosa para evaluar la salud y la función de la fibra muscular madura en respuesta a la activación eléctrica.
Una limitación del uso de fibras musculares disociadas es la falta de fuerzas externas (es decir, estiramiento pasivo) aplicadas a las fibras, lo que resulta en longitudes de sarcómero en reposo más bajas en comparación con las que se encuentran in vivo. Aunque una longitud de sarcómero de 2.4-2.5 μm asegura una producción de fuerza óptima, la longitud del sarcómero en reposo puede variar mucho33. Si bien aún no se ha descrito la longitud del sarcómero en reposo in vivo del FDB, nuestros propios datos no publicados sugieren una longitud promedio de 2,2 μm. Los resultados actuales muestran una longitud promedio de sarcómero en reposo de ~ 1.95 μm en fibras FDB descargadas después de 24 h en cultivo (Figura 3). Aunque esta menor longitud de sarcómero en reposo resultaría en una menor producción de fuerza, una longitud de ~ 1.95 μm aún debería producir >90% de la fuerza máxima34. Como tal, estas longitudes de sarcómero deberían ser suficientes para determinar las diferencias en la función de la fibra entre diferentes modelos genéticos o después de tratamientos farmacológicos. Además, la incrustación de fibras en un hidrogel proporciona muchos puntos adicionales para la adhesión en comparación con las fibras cultivadas 2D que flotan libremente, lo que limitaría aún más el acortamiento del sarcómero con el tiempo.
Una ventaja de este protocolo de aislamiento de fibras musculares es el uso de un músculo de contracción rápida fácilmente diseccionable que consiste en fibras musculares relativamente pequeñas en comparación con otros músculos, como el extensor largo de los dedos (EDL). Su tamaño más pequeño hace que el aislamiento muscular sea más adecuado para la separación basada en la trituración, reduciendo así la posibilidad de daño inducido por pipetas o enredos a las fibras musculares. La matriz extracelular de los músculos FDB se puede digerir fácilmente enzimáticamente con colagenasa, lo que permite el aislamiento de cientos de fibras musculares en un corto período de tiempo. Sin embargo, la digestión excesiva puede provocar daños en las fibras musculares. La sobredigestión de las fibras musculares se puede reconocer cuando el músculo se deshace casi instantáneamente al triturar el músculo o cuando una gran proporción del volumen celular se hipercontrae durante el procedimiento de siembra celular. Para evitar la sobredigestión del músculo, el tiempo de digestión debe optimizarse para cada lote de colagenasa. Para probar esto, dos músculos FDB deben ser digeridos en paralelo con un tiempo de digestión escalonada de 5 minutos entre ellos. Se debe elegir el tiempo de digestión con el mayor rendimiento de fibras musculares viables. Esta optimización debe realizarse una segunda vez, nuevamente con 5 minutos de separación en el tiempo de digestión. El tiempo de digestión que produce las fibras musculares viables más altas debe usarse como el tiempo de digestión óptimo para el lote actual de colagenasa. Otra forma de limitar la variabilidad de lote a lote de la colagenasa sería calcular directamente las unidades de actividad por mililitro de solución madre y luego reconstituir los lotes posteriores de colagenasa a la misma cantidad. Por último, los tiempos de digestión pueden necesitar ser optimizados en diferentes cepas de ratón, por ejemplo, si se estudian animales ancianos o enfermos que exhiben una mayor deposición de matriz extracelular35,36.
La posibilidad de pipetear fibras musculares aisladas viables abre posibilidades para cultivar fibras musculares FDB en diversas condiciones de cultivo. Una de estas opciones es el cultivo de estas fibras en hidrogeles para imitar el entorno de cultivo de tejidos nativos. Este protocolo de incrustación garantiza que las fibras permanezcan en su lugar durante las mediciones contráctiles y se ha optimizado para permitir que las fibras se depositen en el fondo de la placa antes de que el gel se fije. Sin embargo, puede ser necesario ajustar este protocolo para acomodar las diferencias en las reservas de trombina y fibrinógeno. Si la actividad de la trombina es demasiado alta, el gel se fijará prematuramente y las fibras pueden permanecer suspendidas en lugares más altos fuera del plano focal del microscopio. Si esto sucede, la relación trombina:fibrinógeno debe ajustarse. Esto se puede probar chapando fibras en concentraciones de trombina cada vez más bajas y tomando nota de cuánto tiempo lleva la polimerización. Por lo general, esto no debe suceder más rápido que 30 minutos. Sin embargo, tener una concentración de trombina demasiado baja también puede perjudicar el proceso de polimerización. Otro método para asegurarse de que las fibras estén en el plano focal correcto es sembrarlas primero utilizando un protocolo 2D y luego agregar una capa de hidrogel sobre las fibras después de que se hayan adherido a la placa de cultivo. Sin embargo, uno debe ser consciente de que la eliminación del medio de las fibras puede inducir hipercontracción, ya que son sensibles a la desecación. Tampoco está claro si el hidrogel se adherirá completamente a la placa de cultivo, y podría soltarse más fácilmente. Por lo tanto, este procedimiento de incrustación es preferible para mantener las fibras viables y en su lugar para las mediciones de contracción.
El uso de este protocolo permite el estudio de la dinámica contráctil de las fibras musculares maduras ex vivo y se puede aplicar tanto a ratones sanos como a aquellos portadores de mutaciones genéticas para enfermedades musculares. Del mismo modo, permite probar cómo las condiciones de cultivo o la adición de compuestos afectan la función de la fibra muscular. Los datos contráctiles obtenidos utilizando el sistema basado en óptica dan una indicación de la capacidad contráctil de las fibras musculares individuales vivas, y los cambios en esta capacidad pueden correlacionarse con la salud de la fibra. Sin embargo, estos datos por sí solos no son suficientes para determinar si estos cambios ocurren en las etapas de puente cruzado de actina-miosina o liberación de calcio de la contracción muscular. Aunque no describimos métodos para medir la señalización de calcio en este protocolo, esta configuración también es capaz de medir transitorios de calcio basados en Fura en células musculares en contracción29. Un inconveniente de este sistema es que el músculo FDB contiene solo fibras musculares de contracción rápida tipo IIa/IIx, y los músculos que contienen fibras de contracción lenta tipo I de este tamaño aún no han sido descritos37. Esto elimina la capacidad de estudiar el funcionamiento específico del tipo de fibra utilizando este método. El protocolo que proponemos aquí podría adaptarse potencialmente para otros músculos como el EDL o el sóleo para estudiar las diferencias de tipo de fibra. Debido a su mayor tamaño, este protocolo tendría que ser optimizado aún más para estos músculos. Las fibras más largas tienden a enredarse durante la etapa de sedimentación por gravedad y se romperán si se manipulan mediante pipeteo, lo que conduciría a un menor rendimiento. Debido a su incompatibilidad con el pipeteo, las fibras más largas son, por lo tanto, también menos compatibles con la técnica de incrustación de gel. Las mediciones de estas fibras todavía se pueden hacer en un formato de cultivo 2D, pero las fibras pueden moverse más durante la contracción debido a su tamaño, lo que afecta la relación señal-ruido. Otra limitación de este sistema es la incapacidad de realizar mediciones de fuerza junto con las mediciones contráctiles, como las mediciones de fuerza que se pueden obtener utilizando otras preparaciones de fibras musculares intactas28. Sin embargo, esta limitación se puede eludir estimando la fuerza generada por la fibra muscular. La fuerza generada de las fibras musculares se puede estimar si se conoce la forma de la fibra muscular durante los estados contraídos y relajados, así como el módulo de Young de la matriz25. No obstante, este sistema basado en la óptica proporciona un enfoque fácil de usar y de alto rendimiento para estudiar la función contráctil muscular y abre una gama de nuevas posibilidades para estudiar enfermedades musculares genéticas e intervenciones terapéuticas.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes y Emmy Manders por su experiencia técnica para ayudar a desarrollar este protocolo. Este trabajo fue apoyado por premios de la Asociación de Distrofia Muscular (Premio de Desarrollo MDA603238 a T.J.K), la Alianza Cardiovascular Holandesa (Beca de Talento a T.J.K) y el Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC, Australia; Fellowship APP1121651 a M.Y).
Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Equipment | |||
24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
MyoPacer | IonOptix | N/a | |
SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
Vannas Spring Scissor – 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
Software | |||
CytoSolver | IonOptix | N/a | |
IonWizard | IonOptix | N/a |