We presenteren een protocol om metabole activiteiten in cellen gereguleerd door aminozuren direct te visualiseren met behulp van deuteriumoxide (zwaar water D2O) gesondeerde gestimuleerde Raman-verstrooiing (DO-SRS) microscopie, die is geïntegreerd met twee-foton excitatie fluorescentiemicroscopie (2PEF).
Essentiële aromatische aminozuren (AAAs) zijn bouwstenen voor het synthetiseren van nieuwe biomassa’s in cellen en het ondersteunen van normale biologische functies. Een overvloedig aanbod van AAAs is bijvoorbeeld belangrijk voor kankercellen om hun snelle groei en deling te behouden. Hiermee is er een stijgende vraag naar een zeer specifieke, niet-invasieve beeldvormingsbenadering met minimale monstervoorbereiding om direct te visualiseren hoe cellen AAAs gebruiken voor hun metabolisme in situ. Hier ontwikkelen we een optisch beeldvormingsplatform dat deuteriumoxide (D2O) sonderen combineert met gestimuleerde Raman-verstrooiing (DO-SRS) en DO-SRS integreert met twee-foton excitatiefluorescentie (2PEF) in een enkele microscoop om de metabole activiteiten van HeLa-cellen onder AAA-regulatie direct te visualiseren. Gezamenlijk biedt het DO-SRS-platform een hoge ruimtelijke resolutie en specificiteit van nieuw gesynthetiseerde eiwitten en lipiden in enkele HeLa-celeenheden. Bovendien kan de 2PEF-modaliteit autofluorescentiesignalen van nicotinamide, adeninedinucleotide (NADH) en flavine op een labelvrije manier detecteren. Het hier beschreven beeldvormingssysteem is compatibel met zowel in vitro als in vivo modellen, wat flexibel is voor verschillende experimenten. De algemene workflow van dit protocol omvat celkweek, kweekmediavoorbereiding, celsynchronisatie, celfixatie en monsterbeeldvorming met DO-SRS- en 2PEF-modaliteiten.
Omdat ze essentiële aromatische aminozuren (AAAs) zijn, kunnen fenylalanine (Phe) en tryptofaan (Tryp) door het menselijk lichaam worden geabsorbeerd om nieuwe moleculen te synthetiseren voor het ondersteunen van normale biologische functies1. Phe is nodig voor de synthese van eiwitten, melanine en tyrosine, terwijl Tryp nodig is voor de synthese van melatonine, serotonine en niacine 2,3. Overmatige consumptie van deze AAAs kan echter het zoogdierdoel van de rapamycine (mTOR) -route upreguleren, AMP-geactiveerd eiwitkinase remmen en interfereren met het mitochondriale metabolisme, waardoor de biosynthese van macromoleculen collectief wordt gewijzigd en leidt tot de productie van kwaadaardige voorlopers, zoals reactieve zuurstofsoorten (ROS) in gezonde cellen 4,5,6. Directe visualisatie van veranderde metabole dynamiek onder overmatige AAA-regulatie is essentieel om de rol van AAAs te begrijpen bij het bevorderen van de ontwikkeling van kanker en de groei van gezonde cellen 7,8,9.
Traditionele AAA-studies zijn gebaseerd op gaschromatografie (GC)10. Andere methoden, zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI), hebben beperkte ruimtelijke resoluties, waardoor het moeilijk is om cellulaire en subcellulaire analyse van biologische monsters uit te voeren11. Onlangs is matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) ontwikkeld om de rol van AAAs in lipide- en eiwitsyntheses bij kankerproliferatie op te helderen met niet-invasieve biomarkers12,13,14. Deze techniek heeft echter nog steeds last van ondiepe beelddiepten, slechte ruimtelijke resolutie en uitgebreide monstervoorbereiding. Op cellulair niveau kunnen niet-toxische stabiele isotopen, zoals stikstof-15 en koolstof-13, worden getraceerd met multi-isotoopbeeldvorming en secundaire ionenmassaspectrometrie op nanoschaal om hun opname in macromoleculen te begrijpen. Deze methoden zijn echter destructief voor levende biologische monsters15,16. Atomic force microscopy (AFM) is een andere krachtige techniek die metabole dynamica kan visualiseren17. De trage snelheid van scannen tijdens AFM-beeldvorming kan daarentegen beeldvervorming van het resultaat van thermische drift veroorzaken.
We ontwikkelden een niet-invasieve biorthogonale beeldvormingsmodaliteit door deuteriumoxide (D2O) gesondeerde gesonde Raman scattering (DO-SRS) microscopie en labelvrije twee-foton excitatie fluorescentiemicroscopie (2PEF) te koppelen. Deze modaliteit bereikt een hoge ruimtelijke resolutie en chemische specificiteit bij het afbeelden van biologische monsters 18,19,20,21,22,23,24. Dit protocol introduceert de toepassingen van DO-SRS en 2PEF om de metabole dynamiek van lipiden, eiwit- en redoxverhoudingsveranderingen tijdens kankerprogressies te onderzoeken. Omdat D2O een stabiele isotoopvorm van water is, kunnen cellulaire biomoleculen worden gelabeld met deuterium (D) vanwege de snelle compensatie met totaal lichaamswater in cellen, waarbij koolstof-deuterium (C-D) bindingen worden gevormd door enzymatische uitwisseling21. De C-D-bindingen in nieuw gesynthetiseerde macromoleculen, waaronder lipiden, eiwitten, DNA / RNA en koolhydraten, kunnen worden gedetecteerd in het celstille gebied van het Raman-spectrum 20,21,22,25,26,27. Met twee gesynchroniseerde laserpulsen kunnen C-D-bindingen van nieuw gesynthetiseerde lipiden en eiwitten via hyperspectrale beeldvorming (HSI) op afzonderlijke cellen worden weergegeven zonder ze te extraheren of te labelen met cytotoxische middelen. Bovendien heeft SRS-microscopie de mogelijkheid om driedimensionale (3D) modellen te construeren van geselecteerde regio’s van belang in biologische monsters door een reeks dwarsdoorsnedebeelden vast te leggen en te combineren22,26. Met hyperspectrale en 3D-volumetrische beeldvorming kan DO-SRS ruimtelijke verdelingen van nieuw gesynthetiseerde macromoleculen in afzonderlijke cellen verkrijgen, samen met het type organellen dat het proces van het bevorderen van kankergroei onder AAA-verordening22 vergemakkelijkt. Bovendien kunnen we met behulp van 2PEF autofluorescentiesignalen van flavine en nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) verkrijgen met hoge resolutie, diepe penetratiediepte en schade op laag niveau in biologische monsters21,23,24. Flavine- en NADH-autofluorescentiesignalen zijn gebruikt om redoxhomeostase en lipideperoxidatie in kankercellen te karakteriseren22,26. Als zodanig biedt de koppeling van DO-SRS en 2PEF niet alleen subcellulaire analyse van AAA-gereguleerde metabole dynamiek in kankercellen met een hoge ruimtelijke distributie, chemische specificiteitsinformatie en minimale monstervoorbereiding, maar de methode vermindert ook de noodzaak om endogene moleculen te extraheren of te labelen met toxische reagentia. In dit protocol presenteren we eerst de procedures van D2O en aminozuurpreparaat, evenals kankercelkweek. Vervolgens tonen we de protocollen van DO-SRS imaging en 2PEF imaging. Ten slotte presenteren we de representatieve resultaten van SRS- en 2PEF-beeldvorming, die AAA-gereguleerde metabole veranderingen van lipiden en eiwitten en redoxratioveranderingen in kankercellen aantonen. Een gedetailleerde illustratie van het proces is gemarkeerd in figuur 1.
DO-SRS en 2PEF beeldvorming zijn toegepast om metabole dynamica te onderzoeken in verschillende ex vivo modellen, waaronder Drosophila en menselijke weefsels 21,22,23,24,26,27,33. De beeldvormingsmodaliteit die in deze studie wordt gebruikt, integreert DO-SRS en 2PEF-microscopie, di…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Dr. Yajuan Li en Anthony Fung voor hun technische ondersteuning en het Fraley-lab voor de cellijn. We erkennen de start-upfondsen van UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 en Hellman Fellow Award.
10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
Centrifuge | |||
Condenser | Olympus | ||
Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
DC power supply | TopWard | 6302D | |
Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer – Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
Penicillin/Streptomycin | Thermofischer – Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
Silicon Wafer | |||
Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
Tweezers | Kaverme – Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |