Imagen química bioortogonal del metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos
Summary
Presentamos un protocolo para visualizar directamente las actividades metabólicas en células reguladas por aminoácidos utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada con sonda de óxido de deuterio (agua pesada D2O) (DO-SRS), que se integra con microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones (2PEF).
Abstract
Los aminoácidos aromáticos esenciales (AAA) son componentes básicos para sintetizar nuevas biomasas en las células y mantener las funciones biológicas normales. Por ejemplo, un suministro abundante de AAA es importante para que las células cancerosas mantengan su rápido crecimiento y división. Con esto, existe una creciente demanda de un enfoque de imagen altamente específico y no invasivo con una preparación mínima de la muestra para visualizar directamente cómo las células aprovechan los AAA para su metabolismo in situ. Aquí, desarrollamos una plataforma de imágenes ópticas que combina el sondeo de óxido de deuterio (D2O) con la dispersión Raman estimulada (DO-SRS) e integra DO-SRS con fluorescencia de excitación de dos fotones (2PEF) en un solo microscopio para visualizar directamente las actividades metabólicas de las células HeLa bajo regulación AAA. En conjunto, la plataforma DO-SRS proporciona una alta resolución espacial y especificidad de proteínas y lípidos recién sintetizados en unidades celulares HeLa individuales. Además, la modalidad 2PEF puede detectar señales de autofluorescencia de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavina de forma libre de marcas. El sistema de imágenes descrito aquí es compatible con modelos in vitro e in vivo , lo que es flexible para varios experimentos. El flujo de trabajo general de este protocolo incluye el cultivo celular, la preparación de los medios de cultivo, la sincronización celular, la fijación celular y la obtención de imágenes de muestras con las modalidades DO-SRS y 2PEF.
Introduction
Al ser aminoácidos aromáticos esenciales (AAA), la fenilalanina (Phe) y el triptófano (Tryp) pueden ser absorbidos por el cuerpo humano para sintetizar nuevas moléculas para mantener las funciones biológicas normales1. La Phe es necesaria para la síntesis de proteínas, melanina y tirosina, mientras que Tryp es necesaria para la síntesis de melatonina, serotonina y niacina 2,3. Sin embargo, el consumo excesivo de estos AAA puede aumentar la diana de la vía de la rapamicina (mTOR) en los mamíferos, inhibir la proteína quinasa activada por AMP e interferir con el metabolismo mitocondrial, alterando colectivamente la biosíntesis de macromoléculas y conduciendo a la producción de precursores malignos, como las especies reactivas de oxígeno (ROS) en células sanas 4,5,6. La visualización directa de la dinámica metabólica alterada bajo un exceso de regulación de AAA es esencial para comprender el papel de los AAA en la promoción del desarrollo del cáncer y el crecimiento de células sanas 7,8,9.
Los estudios tradicionales de AAA se basan en la cromatografía de gases (GC)10. Otros métodos, como la resonancia magnética (RM), tienen resoluciones espaciales limitadas, lo que dificulta la realización de análisis celulares y subcelulares de muestras biológicas11. Recientemente, se ha desarrollado la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) para dilucidar el papel de los AAA en la síntesis de lípidos y proteínas en la proliferación del cáncer con biomarcadores no invasivos12,13,14. Sin embargo, esta técnica todavía adolece de profundidades de imagen poco profundas, poca resolución espacial y una amplia preparación de la muestra. A nivel celular, los isótopos estables no tóxicos, como el nitrógeno-15 y el carbono-13, se pueden rastrear con imágenes de isótopos múltiples y espectrometría de masas de iones secundarios a nanoescala para comprender su incorporación en macromoléculas. Sin embargo, estos métodos son destructivos para las muestras biológicas vivas15,16. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es otra técnica poderosa que puede visualizar la dinámica metabólica17. Por otro lado, la lentitud de la exploración durante las imágenes AFM puede provocar una distorsión de la imagen del resultado debido a la deriva térmica.
Desarrollamos una modalidad de imagen biortogonal no invasiva mediante el acoplamiento de la microscopía de dispersión Raman estimulada por sonda de óxido de deuterio (D2O) y la microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones sin marcaje (2PEF). Esta modalidad logra una alta resolución espacial y especificidad química al tomar imágenes de muestras biológicas 18,19,20,21,22,23,24. Este protocolo presenta las aplicaciones de DO-SRS y 2PEF para examinar la dinámica metabólica de los lípidos, las proteínas y los cambios en la proporción redox durante la progresión del cáncer. Dado que elD2Oes una forma isotópica estable del agua, las biomoléculas celulares pueden marcarse con deuterio (D) debido a su rápida compensación con el agua corporal total en las células, formando enlaces carbono-deuterio (C-D) a través del intercambio enzimático21. Los enlaces C-D en macromoléculas recién sintetizadas, incluidos lípidos, proteínas, ADN/ARN y carbohidratos, se pueden detectar en la región silenciosa celular del espectro Raman 20,21,22,25,26,27. Con dos pulsos láser sincronizados, los enlaces C-D de lípidos y proteínas recién sintetizados se pueden mostrar en células individuales a través de imágenes hiperespectrales (HSI) sin extraerlos ni marcarlos con agentes citotóxicos. Además, la microscopía SRS tiene la capacidad de construir modelos tridimensionales (3D) de regiones seleccionadas de interés en muestras biológicas mediante la captura y combinación de un conjunto de imágenes transversales22,26. Con imágenes hiperespectrales y volumétricas en 3D, DO-SRS puede obtener distribuciones espaciales de macromoléculas recién sintetizadas en células individuales, junto con el tipo de orgánulos que facilitan el proceso de promoción del crecimiento del cáncer bajo la regulación AAA22. Además, utilizando 2PEF, podemos obtener señales de autofluorescencia de flavina y nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) con alta resolución, profundidad de penetración profunda y daño de bajo nivel en muestras biológicas21,23,24. Las señales de autofluorescencia de flavina y NADH se han utilizado para caracterizar la homeostasis redox y la peroxidación lipídica en células cancerosas22,26. Como tal, el acoplamiento de DO-SRS y 2PEF no solo proporciona un análisis subcelular de la dinámica metabólica regulada por AAA en células cancerosas con alta distribución espacial, información de especificidad química y preparación mínima de muestras, sino que el método también reduce la necesidad de extraer o marcar moléculas endógenas con reactivos tóxicos. En este protocolo, primero presentamos los procedimientos de preparación deD2Oy aminoácidos, así como el cultivo de células cancerosas. A continuación, se muestran los protocolos de imagen DO-SRS y 2PEF. Finalmente, presentamos los resultados representativos de las imágenes SRS y 2PEF, que demuestran los cambios metabólicos regulados por AAA de lípidos y proteínas, y los cambios en la relación redox en las células cancerosas. En la Figura 1 se destaca una ilustración detallada del proceso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las imágenes DO-SRS y 2PEF se han aplicado para investigar la dinámica metabólica en varios modelos ex vivo, incluyendo Drosophila y tejidos humanos 21,22,23,24,26,27,33. La modalidad de imagen utilizada en este estudio integra DO-SRS y microscopía 2PEF, que puede superar a otro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Yajuan Li y Anthony Fung por su apoyo técnico, y al laboratorio Fraley por la línea celular. Agradecemos los fondos iniciales de UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 y Hellman Fellow Award.
Materials
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer – Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer – Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme – Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
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