Summary
本研究描述了一种小鼠模型,用于研究尼古丁对实验性矽肺小鼠肺纤维化进展的协同作用。双重暴露小鼠模型模拟同时暴露于尼古丁和二氧化硅后肺部的病理进展。所描述的方法简单且可重复性高。
Abstract
吸烟和接触二氧化硅在职业工人中很常见,二氧化硅比不吸烟者更容易伤害吸烟者的肺部。尼古丁是香烟中的主要成瘾成分,在矽肺病发展中的作用尚不清楚。本研究采用的小鼠模型简单易控,通过上皮-间充质转化,有效模拟了长期摄入尼古丁和反复接触二氧化硅对肺纤维化的影响。此外,该模型可以帮助直接研究尼古丁对矽肺的影响,同时避免香烟烟雾中其他成分的影响。
环境适应后,在40天内每天早晚以12小时的间隔将0.25mg / kg尼古丁溶液皮下注射到颈部松弛的皮肤中。此外,将结晶二氧化硅粉末(1-5μm)悬浮在生理盐水中,稀释至20mg/mL的悬浮液,并使用超声水浴均匀分散。异氟醚麻醉的小鼠通过鼻子吸入50μL这种二氧化硅粉尘悬浮液, 并通过 胸部按摩醒来。在第 5-19 天每天进行二氧化硅暴露。
双重暴露的小鼠模型先暴露于尼古丁,然后暴露于二氧化硅,这与暴露于这两种有害因素的工人的暴露史相匹配。此外,尼古丁通过小鼠的上皮-间充质转化(EMT)促进肺纤维化。该动物模型可用于研究多种因素对矽肺病发展的影响。
Introduction
在某些职业环境中,工人接触二氧化硅是不可避免的,一旦暴露于二氧化硅,即使在从环境中移除后,情况也会恶化。此外,这些工人大多吸烟,传统香烟含有数千种化学物质,关键的成瘾成分是尼古丁1。电子烟在年轻群体中越来越受欢迎2;这些电子烟充当尼古丁输送系统,增加尼古丁的可及性,从而增加肺部易感性和肺炎3.香烟烟雾还会加速暴露于博来霉素的小鼠的肺纤维化4,并增加暴露于二氧化硅的小鼠的肺毒性和纤维化 5,6。然而,尼古丁是否会影响二氧化硅引起的炎症和肺纤维化过程仍有待研究。
通过一次性吸入高剂量二氧化硅到气管中建立的矽肺小鼠模型对小鼠是创伤性的。虽然这种方法很快提供了矽肺病模型,但它与工人反复暴露于二氧化硅的环境的现实不符。因此,我们通过鼻滴反复给予低剂量的二氧化硅悬浮液,建立了暴露于二氧化硅的小鼠模型;该剂量可引起小鼠炎症和纤维化。
为了规避其他香烟成分的影响,将该小鼠模型皮下注射尼古丁到颈部松弛的皮肤中,以确定成瘾成分尼古丁对矽肺病的影响。通过皮下注射,可以实现准确的剂量,从而可以创建尼古丁暴露模型并观察剂量毒性反应以及成瘾。在雄性小鼠中开发了尼古丁成瘾模型,尼古丁注射剂量为0.2-0.4mg / kg 7,8。在该模型中,为了满足成瘾小鼠的药物寻求需求,以12小时的间隔进行两次皮下注射。这种小鼠尼古丁成瘾模型可用于模拟人类吸烟习惯和接触二氧化硅。
单因素动物模型在疾病研究中具有局限性,而这里描述的方法涉及尼古丁和二氧化硅共暴露的双因素小鼠模型。在二氧化硅暴露之前,小鼠预先暴露于尼古丁,以复制吸烟者的尼古丁暴露。随后,从第 5 天到第 19 天进行二氧化硅暴露,以模仿有吸烟史的个人在工作环境中的二氧化硅暴露。
众所周知,肺泡巨噬细胞在调节肺部炎症和纤维化中起着重要作用。巨噬细胞在吸入二氧化硅后不能分解二氧化硅,导致巨噬细胞极化或凋亡9 以及肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和转化生长因子 β (TGF-β) 等细胞因子的释放。M1 巨噬细胞(通过表面标志物 CD86 的存在来识别)是矽肺病炎症反应的主要煽动者,而以 CD206 为标志的 M2 巨噬细胞负责疾病10 的纤维化期。在双重暴露的小鼠中,尼古丁诱导巨噬细胞向二氧化硅损伤肺中 M2 表型极化,从而促进肺纤维化。此外,TGF-β1 是诱导纤维化和 EMT11 的关键;TGF-β1表达的增加通过EMT加速了肺纤维化的进展。该模型成功地分析了尼古丁对矽肺病的影响,并进一步强调了尼古丁戒烟的重要性。
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Protocol
所有程序均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》(NRC第8版)发布的指南进行,并经安徽理工大学动物伦理委员会批准。
1. 动物准备
- 在实验室中以 12 小时的光/暗循环饲养 32 只雄性 C57/BL6 小鼠,年龄为 8 周。确保小鼠可以自由获取食物和水。
- 适应环境2周后,当10周龄小鼠体重23-26g时,利用计算机生成的随机数对动物进行随机分组,不进行分区,产生四组小鼠:对照组(Con)、尼古丁组(Nic)、二氧化硅组(SiO 2)和尼古丁结合二氧化硅组(Nic+SiO2)。
2.尼古丁制备
注意:尼古丁密度为 1.01 g/mL。
- 将尼古丁溶解在无水乙醇中,稀释20倍,制成50mg/mL的尼古丁储备溶液。
- 用无菌生理盐水稀释尼古丁储备溶液 1,000 倍,制成浓度为 0.05 mg/mL 的工作溶液。
注意:将尼古丁存放在避光的地方。储备溶液可在4°C下储存长达1周。
3.二氧化硅制备
- 将无菌结晶二氧化硅悬浮在盐水中以制备20mg / mL二氧化硅悬浮液,并在超声振荡水浴中振荡25分钟。
- 在小鼠接受鼻滴之前,用涡旋振荡器摇动二氧化硅悬浮液3分钟。用 200 μL 移液管上下移液 2x-3 次混合二氧化硅悬浮液,然后取 50 μL 用于鼻滴。
注意:二氧化硅悬浮液应尽快混合 并通过鼻腔 滴注给药。
4.老鼠捕获和尼古丁暴露
- 称量小鼠的重量,并在暴露前每天记录重量。
- 在第1-40天,每天两次(间隔12小时)皮下注射尼古丁到Nic和Nic + SiO2 组的小鼠中。使用尼古丁剂量为0.25mg/kg;例如,确保体重为 25 克的小鼠接收 6.25 μg 尼古丁。对于该小鼠,注射体积如下:6.25 / 0.05 = 125μL。 同时,向Con组中的小鼠注射等体积的盐水。
- 为每组准备所需的 1 mL 注射器,并用它们吸出注射量的尼古丁或生理盐水。在吸收尼古丁之前,首先将0.1-0.2毫升的空气吸入注射器,然后吸取125微升的尼古丁。小心地敲击注射器,用尼古丁填充针头和注射器前端。将含尼古丁的注射器放在避光的托盘中。
注意:在注射时,0.1-0.2 mL 空气位于尼古丁后面,保证所有液体都成功施用于小鼠。 - 用右手抓住鼠标的尾巴,当动物放松时,用左手拇指和食指按压脖子后面的皮肤,从尾巴到头部到耳朵边缘,施加适度的压力。之后,松开右手,用左手小拇指和无名指捏住尾巴和后肢,此时鼠标将被左手完全固定。
注意: 用适当的力抓住鼠标。力量不足容易老鼠咬人,而力量过大则可能导致老鼠窒息。 - 用右手注射,用注射器从头到尾方向刺穿小鼠耳缘附近的颈后部皮肤,并以均匀的速率注射尼古丁。寻找表明注射成功的半圆形皮肤隆起。
注意: 当针头刺入皮肤时,会有阻力感;插入针头后,阻力消失。此时,需要稍微抽出针头以缓慢均匀地注射。
5. 体内二氧化硅暴露
- 在第5-19天,将二氧化硅悬浮液滴入SiO 2和Nic + SiO2组小鼠的鼻腔中。在麻醉机中以3.6mL / h的剂量用2%异氟醚快速麻醉每只小鼠。麻醉后,将鼠标放在一只手掌上,露出鼠标的鼻腔。在 4-8 秒内将 50 μL 二氧化硅悬浮液滴入鼻腔。
- 为了让二氧化硅悬浮液尽快进入肺部,滴注后,用食指轻轻按压小鼠心脏3-5秒,每秒3x-5x,以促进其呼吸频率。
- 待小鼠呼吸逐渐变得均匀后,将小鼠置于笼子中观察3分钟。
- 对于所有接受二氧化硅悬浮液的小鼠,重复步骤1-3。在对照组中,在第 5-19 天向鼻腔滴注 50 μL 无菌盐水。
6. 获取新鲜和固定的肺组织
- 第41天,根据小鼠体重,使用50mg / kg戊巴比妥钠以0.1mL / 20g的剂量腹膜内麻醉小鼠。将四肢固定在泡沫测试板上,并用 75% 的酒精喷洒毛皮。
- 进行心脏灌注以获取新鲜的肺组织,切开腹部中线以露出胸腔,并在右心顶端做一个小开口。然后,从左心顶端缓慢均匀地注入 20 mL 预冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS),使血液从右心顶点的开口流出。取出整个肺叶,将其置于预冷的1.5mL离心管中,并转移到-80°C储存,等待蛋白质提取。
- 用 20 mL 预冷的 PBS 灌注其他小鼠,然后在同一位置灌注 10 mL 4% 多聚甲醛以固定整个肺;将每个肺保存在 30 mL 的 4% PFA 中。
- 72小时后,将固定的肺组织包埋在石蜡中。
- 将肺组织浸入制备的固定剂中,在40°C的超声水浴中浸泡30分钟,然后在75%乙醇,95%乙醇和无水乙醇中脱水50分钟。
- 用二甲苯洗涤 2 次,每次 50 分钟。
- 将组织置于55-60°C的熔化石蜡中2-3小时,使肺组织中的二甲苯逐渐被石蜡取代。
- 用石蜡将肺组织固定在包埋架中,等待蜡块硬化。蜡块硬化后,使用石蜡切片机以4-5μm切片肺。
- 将肺切片置于45°C的超纯水中。 石蜡熔化后,将肺切片加载到贴壁显微镜载玻片上。
7.苏木精和伊红(HE)染色
- 将载玻片在60°C烘烤2小时,并将载玻片置于二甲苯中脱蜡2×30分钟。随后,将载玻片置于无水乙醇,95%乙醇,85%乙醇和75%乙醇中,各5分钟。最后,用超纯水洗涤 3 x 5 分钟。
- 用移液枪将50μL苏木精染色液滴到肺组织上,染色5分钟;然后,用流水清洗切片5分钟。
- 在切片上加入50μL2%盐酸的乙醇溶液,并用蒸馏水冲洗30秒。然后,将 50 μL 伊红染色液加入肺组织进行染色 1 分钟。
- 对石蜡切片进行脱水、透明和密封。
- 在组合塑料染色罐中加入100-150毫升75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇和二甲苯。将载玻片置于75%,85%,95%和无水乙醇中各5分钟以脱水。
- 然后,将载玻片置于二甲苯中5分钟以使其透明。
- 最后,将 20 μL 中性口香糖滴到肺部分,并在载玻片上盖玻片以密封它。
注意:上述步骤在室温下进行。
8. Masson染色
- 脱蜡、水合和洗涤石蜡切片,如步骤7.1所述。
- 用 50 μL 配置的 Weigert 苏木精染色溶液染色切片 7 分钟,然后用 50 μL 酸性乙醇分馏溶液染色 10 秒,并用流水洗涤以使细胞核变蓝。
- 用 50 μL Masson 三色溶液染色切片 4 分钟,并用水洗涤。
- 用蒸馏水冲洗切片1分钟,然后用立春红酸品红色染色7分钟。
- 用弱酸工作溶液(30%盐酸)洗涤切片1-2分钟,用磷钼酸溶液洗涤1-2分钟,用弱酸工作溶液洗涤1-2分钟。
- 将切片在苯胺蓝染色溶液中染色2分钟,然后用弱酸工作溶液洗涤1分钟。
- 用95%乙醇脱水切片,然后用无水乙醇脱水1秒,用二甲苯透明1秒,最后用中性树脂密封,如步骤7.4所述。
9. 免疫组化
- 将切片在60°C烘烤6小时。脱蜡、水合和洗涤石蜡切片,如步骤7.1所述。
- 抗原回收:将切片放入含有足够柠檬酸盐抗原修复溶液的耐热塑料切片盒中,将切片浸没,煮沸20-30分钟。
- 冷却至室温,取出切片,用去离子水冲洗。随后,在含有0.5%吐温-20(PBST)的PBS中浸泡2×5分钟。
- 用疏水笔在载玻片上的肺部分附近画一个环,形成一个疏水圈。
- 向切片中滴加50μL3%过氧化氢溶液(3%H 2 O2),并在室温下避光孵育15分钟,以使内源性过氧化物酶失活。
- 将切片浸泡在PBST中3 x 5分钟。
- 向切片中滴加50μL的5%牛血清蛋白(BSA)-PBST,并在室温下封闭1小时。
- 弃去封闭溶液,向切片中滴加50μL稀释的一抗CD206(稀释度:1:1,500),TGF-β1(稀释度:1:200)和波形蛋白(稀释度:1:2,000),并在4°C下孵育过夜。
注:在这项工作中,所有抗体均在5%BSA中稀释。 - 第二天,将切片放回室温(40分钟)。按照步骤 9.6 中的说明清洗切片。
- 用 5% BSA 稀释二抗。滴加 50 μL 辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释度:1:500),并在室温下孵育 1 小时。按照步骤 9.6 中的说明清洗切片。
- 将 50 μL 与酶标记的二抗相对应的 3,3'-二氨基联苯胺 (DAB) 溶液滴到肺组织上,并在黑色免疫组化湿箱中孵育 5-10 分钟。在显微镜下观察,直到颜色发展为强烈的棕色。用蒸馏水冲洗切片以终止反应。
注意:棕色染色被认为是阳性染色。 - 用 50 μL 苏木精染色剂染色 30 秒,并用流水洗涤。接下来,将切片浸泡在75%,85%,95%和无水乙醇中各3分钟,然后在二甲苯中浸泡2 x 10分钟。按照步骤 7.4 中的说明密封载玻片。
10. 蛋白质印迹分析
- 将肺组织从冰箱中取出,并称重。接下来,每 20 mg 肺组织加入 150 μL 含有 PMSF 的 RIPA 裂解缓冲液。使用手持式匀浆器在冰上裂解小鼠肺3-5分钟,在4°C下轻轻摇动2小时以充分裂解肺组织,在4°C和14,800× g 离心15分钟,并收集上清液。
注:在使用 RIPA 裂解缓冲液前几分钟加入 100 mM 苯甲磺酰氟 (PMSF)。PMSF 的最终浓度为 1 mM(例如,10 μL PMSF + 990 μL RIPA)。 - 按照制造商的说明,使用 BCA 蛋白质浓度试剂盒确定样品的蛋白质浓度。测定后,以最小浓度的蛋白裂解物为碱,用RIPA将同一批的蛋白裂解物稀释至最小浓度,以达到相同的质量和体积。
注:肺组织负荷总量为30μg。 - 将40μL的5x上样缓冲液加入160μL蛋白质裂解物中,并在100°C下加热10分钟。
- 将制备好的10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶组装在蛋白质印迹电泳系统中,加入SDS-PAGE电泳缓冲液,轻轻拉出电泳梳,每孔缓慢均匀地加入20μL蛋白质样品。打开电源,开始在80V下电泳30分钟。蛋白质到达下凝胶层后,切换到100V,并继续电泳60-70分钟。
注意:电泳需要新鲜的电泳缓冲液。 - 通过湿转印将蛋白质转移到 PVDF 膜上。提前用甲醇激活PVDF膜(5-30秒)。取出电泳凝胶板,小心撬开,将隔膜凝胶放入湿转印缓冲液中,做成电转印夹层,组装湿转印系统。用转移缓冲液填充电泳槽,并以 400 mA 转移 90 分钟。
注意:转印缓冲液提前冷却,以避免湿转印过程中高温的影响。 - 用含有0.5%吐温-20(TBST)的Tris缓冲盐水洗涤PVDF膜3 x 5分钟。用在TBST中稀释的5%脱脂牛奶封闭PVDF膜,并在室温下在振荡器上孵育60分钟;然后,用TBST洗涤2分钟。洗涤后,将膜在4°C下孵育过夜,一抗波形蛋白(1:5,000)和GAPDH(1:10,000)在5%BSA中稀释。
- 将膜置于室温下30分钟,并用TBST洗涤5 x 5分钟。洗涤后,将膜与在 5% 脱脂牛奶中稀释的二抗 (1:10,000) 在室温下孵育 60 分钟。
- 将膜,蛋白质面朝上,滴下制备的ECL工作溶液,孵育1-2分钟,并用凝胶成像仪观察结果。使用凝胶成像仪中软件测量的灰度值来评估蛋白质表达水平。
注意:在这里,GAPDH作为内部参考。
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Representative Results
建立了研究尼古丁结合二氧化硅暴露的小鼠模型,以研究尼古丁在小鼠矽肺病进展中的潜在作用。 图1 描述了使用双重暴露小鼠模型的实验程序,该模型将尼古丁注射与二氧化硅悬浮液的鼻腔滴注配对。HE染色观察各组小鼠的病理变化。暴露于尼古丁与二氧化硅结合的小鼠比暴露于尼古丁或单独使用二氧化硅的小鼠具有更严重的肺损伤。淋巴细胞在尼古丁暴露小鼠肺部淋巴管附近增加,形成炎性细胞簇。Masson染色显示,与其他组的肺相比,暴露于尼古丁和二氧化硅的肺部中胶原纤维沉积显着增加,Masson染色定量支持了这一点(图2)。暴露于二氧化硅的小鼠肺泡结构被破坏,巨噬细胞数量增加。然而,在接触尼古丁与二氧化硅结合后,有明显的炎性细胞浸润,并出现成纤维细胞结节。此外,积累的巨噬细胞,尤其是M2巨噬细胞,存在于双暴露组中。M2巨噬细胞对于矽肺病的晚期纤维化阶段至关重要。
此外,在双暴露小鼠的肺部,特别是在淋巴管附近的炎症细胞中,通过免疫组织化学(IHC)染色观察到促纤维化因子TGF-β1的显着增加(图3)。巨噬细胞分泌的 TGF-β1 促进上皮细胞的 EMT 和肺纤维化12。与单独暴露于二氧化硅的小鼠相比,双重暴露小鼠肺部的波形蛋白水平显着升高。IHC 染色和蛋白质定量均表明双暴露小鼠存在严重的 EMT(图 4)。综合证据表明,在TGF-β1上调后,长期接触二氧化硅会促进EMT,导致成纤维细胞增加和进行性纤维化。同时,尼古丁的加入通过加重EMT加速肺纤维化的过程,使肺纤维化更早出现。该模型旨在探索尼古丁对肺纤维化的影响,肺纤维化是人类长期接触二氧化硅的结果。
图 1:小鼠联合暴露于尼古丁和二氧化硅的实验模型的设计。 连续注射尼古丁1-40天,连续鼻腔滴注二氧化硅5-19天。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:尼古丁促进二氧化硅暴露小鼠肺部成纤维细胞肿块的形成。 (A)HE染色用于可视化肺部的病理变化。双暴露小鼠有严重的炎症细胞浸润和纤维化。绿色箭头表示炎性细胞团。比例尺 = 50 μm。 (B)Masson染色用于显示肺部的胶原纤维。比例尺 = 50 μm。 (C)肺中胶原纤维的定量。*p < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:尼古丁和二氧化硅双重暴露小鼠肺部 CD206 阳性细胞和 TGF-β1 增加。 (A)CD206 IHC染色观察双暴露小鼠巨噬细胞的分布和表达。CD206阳性巨噬细胞在尼古丁和二氧化硅联合暴露后在小鼠肺部增加。短箭头代表 CD206 阳性细胞。比例尺 = 50 μm。 (B) TGF-β1 是纤维化的启动子,在双暴露小鼠中升高。长箭头代表TGF-β1阳性细胞。比例尺 = 50 μm。 CD206 和 TGF-β1 的 (C,D) AOD。AOD = IOD(积分光密度)/面积。AOD 反映了每单位面积 CD206 和 TGF-β1 的浓度。*p < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001,****p < 0.0001。缩写:TGF-β1 = 转化生长因子-β;IHC = 免疫组化;AOD = 平均光密度。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:尼古丁通过加重 EMT 促进二氧化硅暴露小鼠的肺纤维化。 (A)IHC染色观察各组波形蛋白表达。波形蛋白在暴露于尼古丁和二氧化硅的小鼠的肺部中强烈表达。比例尺 = 50 μm.(B) 每个暴露组中波形蛋白表达的蛋白质印迹,随着双暴露小鼠肺组织中波形蛋白的增加。(C)与其他组相比,双暴露组波形蛋白AOD值显著升高。(D)波形蛋白与GAPDH的相对蛋白表达水平。双重暴露组的波形蛋白表达明显高于尼古丁或二氧化硅暴露组。*p < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001,****p < 0.0001。缩写:EMT=上皮-间充质转化;AOD = 平均光密度。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
需要双重暴露动物模型来研究同时暴露于尼古丁和结晶二氧化硅的作用和潜在机制。该模型是在这项工作中通过皮下注射尼古丁和鼻滴二氧化硅来实现的。为了确保尼古丁注射成功,操作者必须熟悉抓握老鼠,因为抓握脖子后面的皮肤可能会对它们造成痛苦。因此,让小鼠逐渐适应抓握是很重要的。此外,小鼠二氧化硅暴露的一个关键步骤是鼻滴。为了提高手术的成功率和小鼠的存活率,必须事先练习鼻滴。
进行注射时,注射器应略过小鼠的头部,以避免鼠标看到注射器时发生剧烈挣扎。应用右手牢牢抓住鼠标的尾巴,而左手应小心轻柔地将皮肤推到脖子后部的耳缘,并捏住那里的皮肤。右手松开鼠标尾巴后,应用左手拇指和无名指稳定尾巴和后肢,防止咬伤。右手使用 1 mL 注射器,应将针头以 30° 角从头到尾插入颈部上方松弛的皮肤中。失去阻力后应稍微抽出针头,注射应缓慢均匀地给药。在第5-19天,双暴露组的小鼠暴露于尼古丁和二氧化硅。建议在上午 08:00 注射尼古丁,然后在下午 14:00 滴鼻二氧化硅,晚上 20:00 再次注射尼古丁。两次尼古丁注射必须间隔12小时,以避免反复抓握对小鼠的影响。
进行皮下注射和鼻腔滴漏带来了一些技术挑战。对于皮下注射,应用适当的力抓住小鼠。如果脖子后面的皮肤捏得太紧,鼠标的气道就会被阻塞,很快导致窒息。为了获得最佳强度,应捏住脖子后面的皮肤,直到眼球略微突出。此时,鼠标感觉到最小的疼痛,呼吸顺畅。此外,应使用排空空气的 1 mL 注射器从管中抽出尼古丁注射液,然后再吸入 0.1-0.2 mL 空气。注射前,应轻轻弹出气泡。由于注射量小,留在针端尖端的尼古丁可能会导致剂量不足。注射的关键部分是快速插入针头,缓慢注射尼古丁,然后轻轻取出针头。对于鼻滴,在这项研究中,小鼠的鼻腔在深度麻醉下完全暴露,然后缓慢而均匀地滴注二氧化硅悬浮液。接触二氧化硅后轻轻按压胸腔也很重要,以避免咳嗽或窒息。
这种模式有一定的局限性。实验中使用的1-5μm二氧化硅颗粒不是从环境中收集的,是纯二氧化硅颗粒。相比之下,在实际的职业环境中,工人可能会接触到各种有害物质,而不仅仅是二氧化硅颗粒,例如陶瓷厂或煤矿中的煤和二氧化硅粉尘的混合物。我们使用鼻腔滴注二氧化硅来实现低剂量和重复多次暴露,以模拟工人的慢性暴露。在双重暴露小鼠模型中,虽然尼古丁不是来自香烟烟雾暴露,但注射的尼古丁直接进入血液,可以更集中地探索尼古丁在矽肺病过程中的作用,并避免香烟烟雾中其他成分的影响。
关于矽肺病的科学研究通常利用单因素小鼠模型,通过吸入或支气管灌注二氧化硅来评估二氧化硅在疾病发展中的作用。另一种方法是鼻腔滴注二氧化硅,这简单易行,可以建立重复和慢性二氧化硅暴露模型13。成熟的二氧化硅鼻滴模型对小鼠造成的伤害最小,并且可以与其他因素相结合,以创建多因素暴露的动物模型。此外,小鼠尼古丁暴露的主要方法包括饮用水中的尼古丁、皮下注射尼古丁、 通过 渗透微型泵输注尼古丁和烟草烟雾暴露14。双重暴露模型中使用的皮下注射允许精确设置尼古丁的剂量和时间,确保每只小鼠都给予相同的剂量。
简而言之,尼古丁与二氧化硅暴露相结合的动物模型复制了现实的慢性暴露模式,该模型可用于进一步研究尼古丁对矽肺病发展过程中炎症和纤维化的影响。此外,该模型是形成具有多剂量和时间框架的双重暴露动物模型的基础。
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Disclosures
所有作者都声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
本研究由安徽省高校协同创新计划(GXXT-2021-077)和安徽理工大学研究生创新基金(2021CX2120)资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
Methanol | Macklin | ||
Nicotine | Sigma | N-3876 | |
phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
Pipettes | Eppendorf | ||
Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
Vortex Mixers | VWR | ||
Name of Material/ Equipment | |||
Adobe Illustrator | |||
ImageJ | |||
Photoshop | |||
Prism7.0 |
References
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