إثراء الحويصلات خارج الخلية الأصلية والمؤتلفة من المتفطرات

Summary

يفصل هذا البروتوكول إثراء الحويصلات خارج الخلية المتفطرة الأصلية (mEVs) من الثقافات المحورية للمتفطرة smegmatis (Msm) وكيف يمكن تصميم وإثراء mCherry (مراسل الفلورسنت الأحمر) المحتوي على MSMEVs المؤتلفة. أخيرا ، يتحقق من النهج الجديد مع إثراء MsmEVs التي تحتوي على بروتين EsxA من المتفطرة السلية.

Abstract

معظم البكتيريا ، بما في ذلك المتفطرات ، تولد حويصلات خارج الخلية (EVs). نظرا لأن EVs البكتيرية (bEVs) تحتوي على مجموعة فرعية من المكونات الخلوية ، بما في ذلك المستقلبات والدهون والبروتينات والأحماض النووية ، فقد قامت عدة مجموعات بتقييم الإصدارات الأصلية أو المؤتلفة من bEVs لقوتها الوقائية كمرشحين للقاح الوحدة الفرعية. على عكس المركبات الكهربائية الأصلية ، يتم تصميم المركبات الكهربائية المؤتلفة جزيئيا لتحتوي على واحد أو أكثر من مناعيات الاهتمام. على مدى العقد الماضي ، استكشفت مجموعات مختلفة مناهج متنوعة لتوليد المركبات الكهربائية المؤتلفة. ومع ذلك ، هنا ، نبلغ عن تصميم وبناء وإثراء المركبات الكهربائية المتفطرة المؤتلفة (mEVs) في المتفطرات. نحو ذلك ، نستخدم المتفطرة smegmatis (MSM) ، وهي متفطرة التربة الطيرية كنظام نموذجي. نصف أولا توليد وإثراء المركبات الكهربائية الأصلية ل MSM. بعد ذلك ، نصف تصميم وبناء mEVs المؤتلف التي تحتوي إما على mCherry ، وهو بروتين مراسل فلوري أحمر ، أو EsxA (Esat-6) ، وهو مناعي بارز للمتفطرة السلية. نحقق ذلك عن طريق دمج mCherry و EsxA N-termini بشكل منفصل مع الطرف C لبروتين MSM صغير Cfp-29. Cfp-29 هو واحد من البروتينات القليلة الموجودة بكثرة من MsmEVs. يظل بروتوكول توليد وإثراء المركبات الكهربائية المؤتلفة من MSM مطابقا لتوليد وإثراء المركبات الكهربائية الأصلية من MSM.

Introduction

على الرغم من تطوير وإدارة مجموعة واسعة من اللقاحات ضد الأمراض المعدية ، حتى يومنا هذا ، ~ 30 ٪ من جميع الوفيات البشرية لا تزال تحدث من الأمراض المعدية¹. قبل ظهور لقاح السل (TB) – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – كان السل هو القاتل الأول (~ 10000 إلى 15000 / 100000 نسمة) ². مع إعطاء BCG وسهولة الوصول إلى أدوية الخط الأول والثاني المضادة للسل ، بحلول عام 2022 ، انخفضت الوفيات المرتبطة بالسل بشكل كبير إلى ~ 1 مليون / سنة بحلول عام 2022 (أي ~ 15-20 / 100000 نسمة¹). ومع ذلك ، في السكان الموبوءين بالسل في العالم ، لا تزال الوفيات المرتبطة بالسل تقف عند ~ 100-550 / 100000 نسمة¹. بينما يدرك الخبراء عدة أسباب تؤدي إلى هذه الأرقام المنحرفة ، يبدو أن الحماية بوساطة BCG التي لا تدوم حتى في العقد الأول من العمر هي السبب البارز³،^4،5،^6،7. ونتيجة لذلك، وبالنظر إلى “أهداف التنمية المستدامة” المتجددة للأمم المتحدة و”استراتيجية القضاء على السل” لمنظمة الصحة العالمية، هناك جهد عالمي متضافر لتطوير بديل لقاح أفضل بكثير من لقاح بوسطن كونسلتينج جروب الذي ربما يوفر حماية مدى الحياة من السل.

ولتحقيق هذا الهدف، تقوم عدة مجموعات حاليا بتقييم سلالات BCG المعدلة/المؤتلفة، والأنواع الفطرية غير المسببة للأمراض والموهنة بخلاف BCG، والوحدات الفرعية المرشحة⁸،⁹،10،11،12،13،14،¹⁵،16،^17،18. عادة ما تكون لقاحات الوحدات الفرعية عبارة عن جسيمات شحمية محملة بشكل انتقائي بعدد قليل من البروتينات المناعية النقية (~ 1-6) كاملة الطول أو مبتورة من العامل الممرض. ومع ذلك ، بسبب طيها الزائف إلى توافقات غير أصلية و / أو تفاعلات عشوائية غير وظيفية بين البروتينات المحملة ، غالبا ما تفتقر الوحدات الفرعية إلى الحلقات الأصلية والوثيقة ، وبالتالي تفشل في تجهيز جهاز المناعة بشكل كاف¹⁴،^19،20.

وبالتالي ، اكتسبت الحويصلات خارج الخلية (EVs) للبكتيريا وتيرة كبديل واعد²¹،²²،^23،24،^25،26. عادة ، تحتوي EVs البكتيرية (bEVs) على مجموعة فرعية من مكوناتها الخلوية ، بما في ذلك بعض أجزاء الأحماض النووية والدهون ومئات المستقلبات والبروتينات^27,28. على عكس الجسيمات الشحمية حيث يتم تحميل عدد قليل من البروتينات النقية بشكل مصطنع ، تحتوي bEVs على مئات البروتينات المحملة بشكل طبيعي والمطوية محليا مع ميل أفضل لتجهيز جهاز المناعة ، خاصة بدون تعزيز / مساعدة المواد المساعدة ومستقبلات تشبه الرسوم (TLR)²⁷،^28،29. في هذا الخط من البحث ، استكشفنا نحن وآخرون فائدة المركبات الكهربائية المتفطرة كمعززات محتملة للوحدات الفرعية ل BCG³⁰. على الرغم من المخاوف من أن المركبات الكهربائية تفتقر إلى أحمال مستضدات موحدة ، فقد نجحت المركبات الكهربائية من النيسرية السحائية الموهنة في حماية البشر من المكورات السحائية من المجموعة المصلية^{B 31,32}.

من الناحية النظرية على الأقل ، فإن أفضل المركبات الكهربائية التي يمكن أن تعزز BCG بشكل جيد هي المركبات الكهربائية المخصبة من البكتيريا المسببة للأمراض. ومع ذلك ، فإن إثراء المركبات الكهربائية الناتجة عن المتفطرة المسببة للأمراض مكلف ويستغرق وقتا طويلا ومحفوفا بالمخاطر. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون المركبات الكهربائية الناتجة عن مسببات الأمراض أكثر ضراوة من الحماية. بالنظر إلى المخاطر المحتملة ، هنا ، نبلغ عن بروتوكول تم اختباره جيدا لتخصيب المركبات الكهربائية الناتجة عن MSM المزروعة محوريا ، وهي متفطرة طيرية الطيور.

ومع ذلك ، على الرغم من تشفير العديد من تقويم البروتين الممرض ، تفتقر المتفطرات الفيروسية إلى العديد من مستضدات اللقاح / حوامل البروتين المسببة للأمراض اللازمة لتجهيز الجهاز المناعي بشكل كاف نحو الحماية³³. لذلك ، استكشفنا أيضا بناء وإثراء المركبات الكهربائية المؤتلفة من MSM من خلال الهندسة الجزيئية ، بحيث يجب أن يصل جزء كبير من أي بروتين ممرض مهم يتم التعبير عنه وترجمته في MSM ، إلى EVs. افترضنا أن واحدا أو أكثر من أفضل 10 بروتينات وفيرة من MSM EVs عند دمجها مع البروتين محل الاهتمام سيساعد في هذا النقل.

بينما بدأنا في توحيد إثراء المركبات الكهربائية المتفطرة (mEVs) في مختبرنا ، في عام 2011 ، أبلغ Prados-Rosales et al. لأول مرة عن تصور وإثراء mEVs في المختبر³⁰. في وقت لاحق ، في عام 2014 ، نشرت نفس المجموعة نسخة معدلة من طريقة^{2011 34}. في عام 2015 ، أبلغ Lee et al. أيضا عن طريقة موحدة بشكل مستقل لتخصيب mEV مرة أخرى من الثقافات المحورية للمتفطرات³⁵. من خلال الجمع بين كلا البروتوكولين ^34,35 ودمج بعض تعديلاتنا بعد التوحيد الشامل ، نصف هنا بروتوكولا يساعد بشكل روتيني على إثراء mEVs من الثقافات المحورية للبكتيريا^{الفطرية 36}.

هنا ، نفصل بشكل خاص إثراء المركبات الكهربائية الخاصة ب MSM ، وهو امتداد للبروتوكول^{المنشور 36} لإثراء المركبات الكهربائية المتفطرة بشكل عام. نحن أيضا بالتفصيل كيفية بناء mEVs المؤتلف (R-mEVs) التي تحتوي على بروتين mCherry (كمراسل فلوري أحمر) و EsxA (Esat-6) ³⁷،^38،39 وهو مناعي سائد ووحدة فرعية محتملة لقاح المتفطرة السلية. يظل بروتوكول إثراء R-mEVs مطابقا للبروتوكول الذي وصفناه لإثراء المركبات الكهربائية الأصلية من MSM.

Protocol

1. ظروف نمو المتفطرة السميغماتية ، الإشريكية القولونية ، ومشتقاتها وسائطميدلبروك 7H9 مرق السائلقم بإعداد محلول مخزون Tween-80 بنسبة 20٪ عن طريق التسخين المسبق للحجم المطلوب من الماء المقطر المزدوج (ddw) في دورق زجاجي إلى ~ 45-50 درجة مئويةفي …

Representative Results

نستخدم M. smegmatis (Msm) كنموذج المتفطرة لإثبات إثراء كل من mEVs الأصلية والمؤتلفة (R-mEVs). يعمل بروتوكول إثراء mEVs الملخص تخطيطيا (الشكل 1) أيضا على إثراء R-mEVs من MSM والمركبات الكهربائية الأصلية ل Mtb (مع تعديلات طفيفة كما في ملاحظات البروتوكول 1.2). يتطلب تصور mEVs المخصب تلطيخها سلبا تح…

Discussion

نظرا لأن تطوير لقاح جديد للسل يتفوق على BCG ويمكن أن يحل محله لا يزال يمثل تحديا هائلا ، كبديل ، تسعى العديد من المجموعات إلى اكتشاف لقاحات السل الفرعية المختلفة التي يمكن أن تعزز فعالية BCG وتطيل مدة الحماية^48,49. نظرا للاهتمام المتزايد بالمركبات الكهربائية الب…

Materials

A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155