ショウジョウバエ(ショウジョウバエメラノガスター)は、生物学的および毒物学的研究に広く使用されています。ハエの有用性を拡大するために、複数のハエサンプルを同時に揮発性全身麻酔薬(VGA)にさらす装置、シリアル麻酔アレイを開発し、VGAの付随的影響(毒性と保護性)を調査できるようにしました。
揮発性全身麻酔薬(VGA)は、世界中のあらゆる年齢や病状の何百万人もの人々に使用されています。高濃度のVGA(数百マイクロモルから低ミリモル)は、観察者に「麻酔」として提示する脳機能の深遠で非生理学的な抑制を達成するために必要です。そのような高濃度の親油性物質によって引き起こされる付随的効果の全範囲は知られていないが、それらの生物学的意義は理解されていないが、免疫炎症系との相互作用が注目されている。
動物におけるVGAの生物学的影響を調べるために、ショウジョウバエ(ショウジョウバエメラノガスター)が提供する実験上の利点を活用するために、シリアル麻酔アレイ(SAA)と呼ばれるシステムを開発しました。SAAは、直列に配置され、共通の流入に接続された8つのチャンバーで構成されています。一部の部品はラボで入手でき、他の部品は簡単に製造または購入できます。VGAの校正された投与に必要な気化器は、市販されている唯一のコンポーネントです。VGAは、バルク(通常95%以上)がキャリアガスであるため、運転中にSAAを流れる大気のごく一部にすぎません。デフォルトの運送業者は航空です。ただし、酸素やその他のガスは調査できます。
従来のシステムに対するSAAの主な利点は、複数のハエのコホートを正確に滴定可能な量のVGAに同時に曝露できることです。VGAの濃度は、すべてのチャンバーで数分以内に達成されるため、区別できない実験条件が得られます。各チャンバーには、単一のハエから数百のハエを含めることができます。例えば、SAAは、8つの異なる遺伝子型、または異なる生物学的変数(男性対女性、老人と若年者など)を持つ4つの遺伝子型を同時に調べることができます。SAAを使用して、神経炎症-ミトコンドリア変異体と外傷性脳損傷(TBI)に関連する2つの実験的ハエモデルでVGAの薬力学とその薬理遺伝学的相互作用を調査しました。
側副麻酔効果(すなわち、すぐには観察できないが行動上の結果を遅らせる可能性のある効果)の存在は一般に受け入れられているが、それらのメカニズムと危険因子の理解は初歩的なままである1,2。それらの遅延した発現と微妙さは、合理的な時間枠内で許容可能なコストで哺乳類モデルで調査できる潜在的に重要な変数の数を制限します。ショウジョウバエ(ショウジョウバエメラノガスター)は、神経変性疾患3および毒物学的スクリーニング4の文脈において、これまで麻酔薬の副次的効果の研究に適用されていない独自の利点を提供します。
私たちは、麻酔薬力学と薬理遺伝学の研究におけるショウジョウバエの使用を容易にするために、連続麻酔アレイ(SAA)を開発しました。SAAの主な利点は、複数のコホートの同一の実験条件に同時にばく露できることです。ショウジョウバエの実験の柔軟性と組み合わせると、SAAのハイスループットにより、哺乳類モデルでは不可能な規模での生物学的および環境変数の探索が可能になります。
原則として、SAAは、キャリアガスが揮発性物質を送達する一連の接続された麻酔場所(50mLバイアルで作られたチャンバー)です。システムの最初のチャンバーには、キャリアガスが加湿される蒸留水が含まれており(ハエは脱水に敏感です)、システムを通るガスの流れを示す単純な流量インジケータで終了します。接続チューブの開口部に配置された細かいネットは、チャンバー間のハエの移動を防ぐためにチャンバーを分離します。「直列」の場所の数は、加圧されていないガスの流れ(チューブ、ネット)に対する抵抗によって制限されます。
このSAAプロトタイプの動力学は、以前の出版物5で特徴付けられました。正確な薬物動態特性はSAAによって異なりますが、実験的にテストされた関連する基本は次のとおりです:(i)1.5〜2 L / minの初期流量は、すべてのチャンバー(総容量±550 mL)を2分以内に所望の麻酔薬濃度で平衡化します。(ii)チャンバーに送達される麻酔薬蒸気の濃度は、個々のチャンバー内のガスの量(50mL)に含まれる麻酔薬の量が任意の数のハエが吸収する量をはるかに超えているため、最初の場所と最後の場所の間でそれほど変化しません。(iii)チャンバーが平衡化したら、キャリアガスの流れを減らして(50〜100 mL /分以下)、廃棄物や環境汚染を回避できます(揮発性麻酔薬は温室効果ガスの特性を持っています)。蒸気の定常状態濃度を維持するために必要な最小流量は、ハエによる蒸気の取り込みが無視できるため、主にSAAの漏れに依存します。これらの標準条件(2%イソフルランおよび1.5 L / minキャリアガス流量)では、ハエは3〜4分以内にアレイのすべての位置で麻酔(すなわち、動かない)され、位置間の顕著な違いはない。VGAは数分から数時間投与でき、私たちの典型的な曝露パラダイムは15分から2時間の範囲です。システムをフラッシュするために、気化器をオフにし、アレイの約10倍のボリュームを交換するように流量を維持します(5分間で1.5 L / min)。麻酔薬の排泄速度は、設定された流量によって異なります。
揮発性麻酔薬は、免疫炎症系を含む、まだ同定されていない多数の標的と相互作用します6。主要アウトカムと付随的アウトカム(「麻酔状態」と長期および短期の「副作用」)に対する個々の分子標的の寄与はよくわかっていない。したがって、高感度でハイスループットのハエシステムは、ハエと哺乳類の明らかな違いにもかかわらず、高等動物での実験に情報を提供する価値があります7。実際、いくつかの違いは有利です。例えば、ハエの免疫系は、応答8の適応アームを欠いているという点で高等動物の免疫系とは異なります。これはヒトの疾患を理解するための制限のように思えるかもしれませんが、適応応答から分離してVGAと自然免疫炎症反応との相互作用を研究するユニークな機会を提供します9。これにより、炎症に対するVGAの薬理学的効果と、集団に存在するさまざまな遺伝的背景によるそれらの調節の研究が可能になります。
SAAの建設における重要なステップには、麻酔薬混合物のガスの漏れを防ぐためのタイトなフィッティングの確保が含まれます。SAAは、実験室スペースの汚染を避けるために、ヒュームフードに収納する必要があります。キャリアガスボンベからSAAの下流の流量インジケータまでのすべての要素は、チェックリストに概説されているようにチェックする必要があります。
VGAをハエに投与する他の方法は、操作が複雑(イブリオメーター)21、低スループット22、複数の集団の同時曝露を許容しない23、麻酔薬濃度の正確な制御を可能にしない21、または臨床的に受け入れられた用語24に変換することが困難な読み出しを有する。
SAAの現在のバージョンは市販の気化器に依存しているため、毒物学的研究は揮発性麻酔薬に限定されています。他の揮発性物質と一緒に使用する場合、出力を校正した後、気化器を「適応外」で使用できます。あるいは、揮発性物質を気化させる別の方法を適用することができ、これは、前述のように、薬物濃度を滴定するための専用の測定を必要とするであろう25。
流量インジケータを除いて、アラームはありません(つまり、タンクが空になると、SAAを通る流れが中断されます)。使用の強度に応じて、SAAはタイゴンチューブの清掃、締め付け、場合によっては交換が必要になる場合があります。オリジナルのSAAの「メンテナンス」は、7年間の使用で2回実行しました。
ショウジョウバエを麻酔するためのこの方法は、ショウ ジョウバエ の研究者が利用できる遺伝子ツールボックスをハイスループットシステムで使用することができます。異なる集団(例えば、遺伝子型、年齢、性別)のハエの複数のコホートは、目前の研究課題に適した同一の麻酔薬濃度およびキャリアガス(空気、O2、N2O、希ガス)の所望の組み合わせに同時に曝露することができる。
ここでは、SAAが ND2360114 フライラインのイソフルラン毒性に対する回復力の予期せぬ変化を明らかにするのに有用であり、標準的な実験室のフライラインはAPに対する応答性が異なることを示しています。 これらの発見を特定することは、実験条件の厳密な管理とSAAの高いスループットのために可能でした。
SAAは、昆虫(ミツバチなど)に対する他の揮発性有機化合物(VOC)の影響を研究するために適応させることができます。蒸気圧が揮発性麻酔薬に近いVOC(イソフルラン:20°Cで240mmHg)の場合、従来の気化器を使用できますが、出力を校正する必要があります。デスフルラン用の市販の気化器は加熱されており、柔軟性を高める可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
ウィスコンシン大学マディソン校麻酔科ピアース研究所のマーク・G・パーキンス氏に、SAAのプロトタイプを製作してくださったことに感謝します。この研究は、国立総合医学研究所(NIGMS)のR01GM134107と、ウィスコンシン大学マディソン校麻酔科のR&D基金の支援を受けています。
Serial Anesthesia Array: | |||
5 mL Serological Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10C | Polystyrene, 5mL serological pipette |
50 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 1495949A | Polypropylene, 50 mL |
Cable Tie Mounting Pad | Grainger | 6EEE6 | 1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H |
Dispensing Syringe | Grainger | 5FVE0 | 10 mL with Luer-Lock Connection |
Fabric Mesh Netting | 1 mm mesh | ||
Flow Indicator | Grainger | 8RH52 | 5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style |
Tygon Tubing | Tygon | E-3603 | ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16 |
Wood Frame | 10 feet of 2 inch x 3/4 inch | ||
Zip Tie | >5inch | ||
Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold): | |||
Dispensing Syringe | Grainger | 5FVE0 | 10 mL with Luer-Lock Connection |
Commercial Manifold and Vaporizers: | |||
1/4 inch Equal Barbed Y Connector | Somni Scientific | BF-9000 | |
1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic) | Somni Scientific | BF-9004 | |
AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob | Somni Scientific | FP-4002 | |
Flowmeter auxiliary mounting bracket | Somni Scientific | NonInvPart | |
Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male | Somni Scientific | GF-11012 | |
TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6' color coded tubing X2. (Vaporizer not Included) | Somni Scientific | TT-17000 | |
Tec 7 Isoflurane Vaporizer | GE Datex-Ohmeda | 1175-9101-000 | Agent-specific vaporizer (Isoflurane) |
Tec 7 Sevoflurane Vaporizer | GE Datex-Ohmeda | 1175-9301-000 | Agent-specific vaporizer (Sevoflurane) |