Evaluatie van de immuunrespons van een nano-emulsie-adjuvansvaccin tegen methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) -infectie
Summary
Het huidige protocol bereidt en evalueert de fysieke eigenschappen, immuunrespons en in vivo beschermend effect van een nieuw nano-emulsie-adjuvans vaccin.
Abstract
Nano-emulsie-adjuvante vaccins hebben uitgebreide aandacht getrokken vanwege hun kleine deeltjesgrootte, hoge thermische stabiliteit en het vermogen om geldig immuunresponsen te induceren. Het vaststellen van een reeks uitgebreide protocollen om de immuunrespons van een nieuw nano-emulsie-adjuvansvaccin te evalueren, is echter van vitaal belang. Daarom bevat dit artikel een rigoureuze procedure om de fysisch-chemische kenmerken van een vaccin te bepalen (door transmissie-elektronenmicroscopie [TEM], atoomkrachtmicroscopie [AFM] en dynamische lichtverstrooiing [DLS]), de stabiliteit van het vaccinantigeen en -systeem (door een hogesnelheidscentrifugetest, een thermodynamische stabiliteitstest, SDS-PAGE en western blot) en de specifieke immuunrespons (IgG1, IgG2a en IgG2b). Met behulp van deze aanpak kunnen onderzoekers het beschermende effect van een nieuw nano-emulsieadjuvansvaccin in een dodelijk MRSA252 muismodel nauwkeurig evalueren. Met deze protocollen kan het meest veelbelovende nano-emulsievaccinadjuvans in termen van effectief adjuvanspotentieel worden geïdentificeerd. Bovendien kunnen de methoden helpen bij het optimaliseren van nieuwe vaccins voor toekomstige ontwikkeling.
Introduction
Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) is een opportunistische ziekteverwekker met een van de hoogste infectiepercentages op een intensive care unit (ICU) afdeling1, cardiologieafdelingen en brandwondenafdelingen wereldwijd. MRSA vertoont hoge infectiepercentages, mortaliteit en brede resistentie tegen geneesmiddelen, wat grote problemen oplevert bij klinische behandeling2. In de wereldwijde prioriteitenlijst van antibioticaresistente bacteriën die in 2017 door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) werd vrijgegeven, werd MRSA opgenomen in de meest kritieke categorie3. Een vaccin tegen MRSA-infectie is daarom dringend nodig.
Aluminiumadjuvans wordt al lange tijd gebruikt en het hulpmechanisme van het adjuvans is relatief duidelijk, veilig, effectief en goed verdragen4. Aluminium adjuvantia zijn momenteel een veel gebruikt type adjuvans. Over het algemeen wordt aangenomen dat antigenen geadsorbeerd aan aluminiumzoutdeeltjes de stabiliteit kunnen verbeteren en het vermogen van de injectieplaats om antigenen op te nemen kunnen verbeteren, wat zorgt voor een goede absorptie en langzame afgifte5. Momenteel is het grootste nadeel van aluminiumadjuvantia dat ze geen adjuvans effect hebben of slechts een zwak adjuvans effect vertonen op sommige kandidaat-vaccinantigenen6. Bovendien induceren aluminiumadjuvantia IgE-gemedieerde overgevoeligheidsreacties5. Daarom is het noodzakelijk om nieuwe adjuvantia te ontwikkelen om een sterkere immuunrespons te stimuleren.
Nano-emulsie-adjuvantia zijn colloïdale dispersiesystemen die bestaan uit olie, water, oppervlakteactieve stoffen en cosurfactanten7. Bovendien zijn de adjuvantia thermodynamisch stabiel en isotroop, kunnen ze worden geautoclaveerd of gestabiliseerd door centrifugatie met hoge snelheid en kunnen ze spontaan worden gevormd onder milde bereidingsomstandigheden. Verschillende emulsie-adjuvantia (zoals MF59, NB001-002-serie, AS01-04-serie, enz.) zijn momenteel op de markt of in de klinische onderzoeksfase, maar hun deeltjesgroottes zijn groter dan 160 nm8. Daarom kunnen de voordelen van medicinale preparaten op nanoschaal (1-100 nm) (d.w.z. groot specifiek oppervlak, kleine deeltjesgrootte, oppervlakte-effect, hoge oppervlakte-energie, klein effect en macro-kwantumtunneleffect) niet volledig worden benut. In het huidige protocol is gemeld dat een nieuw adjuvans op basis van nano-emulsietechnologie met een diametergrootte van 1-100 nm een goede adjuvante activiteit vertoont9. We testten het recombinatiesubunitvaccinantigeeneiwit HI (α-hemolysinemutant [Hla] en Fe-ionenoppervlakbepalende factor B [IsdB] subunit N2 actief fragmentfusie-eiwit); Een reeks procedures werd vastgesteld om de fysieke eigenschappen en stabiliteit te onderzoeken, de specifieke antilichaamrespons na intramusculaire toediening te evalueren en het beschermende effect van het vaccin te testen met behulp van een systemisch infectiemodel voor muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
IsdB, een bacterieel celwandverankerd en ijzergereguleerd oppervlakte-eiwit, speelt een belangrijke rol in het proces van het verkrijgen van heemijzer15. Hla, alfatoxine, is een van de meest effectieve bacteriële toxines die bekend zijn bij MRSA en kan poriën vormen in eukaryote cellen en interfereren met adhesie- en epitheelcellen16. In onze studie werd een nieuw recombinatie MRSA-antigeeneiwit (HI) geconstrueerd en tot expressie gebracht met gentechnol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door nr. 2021YFC2302603 van het National Key Research and Development Program van China, nr. 32070924 en 32000651 van de NSFC, en nr. 2019jcyjA-msxmx0159 van het Natural Science Foundation Project Program van Chongqing.
Materials
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O’Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. . Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
- Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).
