Avaliação da Resposta Imune de uma Vacina Adjuvante em Nanoemulsão Contra a Infecção por Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA)
Summary
O presente protocolo prepara e avalia as propriedades físicas, a resposta imune e o efeito protetor in vivo de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão.
Abstract
As vacinas adjuvantes em nanoemulsão têm atraído grande atenção devido ao seu pequeno tamanho de partículas, alta estabilidade térmica e capacidade de induzir respostas validamente imunes. No entanto, o estabelecimento de uma série de protocolos abrangentes para avaliar a resposta imune de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão é vital. Portanto, este artigo apresenta um procedimento rigoroso para determinar as características físico-químicas de uma vacina (por microscopia eletrônica de transmissão [MET], microscopia de força atômica [AFM] e espalhamento dinâmico de luz [DLS]), a estabilidade do antígeno e do sistema vacinal (por um teste de centrífuga de alta velocidade, um teste de estabilidade termodinâmica, SDS-PAGE e western blot) e a resposta imune específica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Usando essa abordagem, os pesquisadores podem avaliar com precisão o efeito protetor de uma nova vacina adjuvante de nanoemulsão em um modelo de camundongo MRSA252 letal. Com esses protocolos, pode-se identificar o adjuvante vacinal em nanoemulsão mais promissor em termos de potencial adjuvante efetivo. Além disso, os métodos podem ajudar a otimizar novas vacinas para desenvolvimento futuro.
Introduction
Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um patógeno oportunista com uma das mais altas taxas de infecção em enfermarias de unidade de terapia intensiva (UTI)1, departamentos de cardiologia e departamentos de queimados em todo o mundo. MRSA apresenta altas taxas de infecção, mortalidade e ampla resistência a drogas, apresentando grandes dificuldades no tratamento clínico2. Na Lista Global Prioritária de Bactérias Resistentes a Antibióticos divulgada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2017, o MRSA foi listado na categoria3 mais crítica. Uma vacina contra a infecção por MRSA é, portanto, urgentemente necessária.
O adjuvante de alumínio é utilizado há muito tempo, e o mecanismo auxiliar do adjuvante é relativamente claro, seguro, eficaz e bem tolerado4. Os adjuvantes de alumínio são atualmente um tipo de adjuvante amplamente utilizado. Acredita-se que antígenos adsorvidos em partículas de sal de alumínio possam melhorar a estabilidade e aumentar a capacidade do local de injeção de captar antígenos, proporcionando boa absorção e liberação lenta5. Atualmente, a principal desvantagem dos adjuvantes de alumínio é que eles não têm efeito adjuvante ou exibem apenas um fraco efeito adjuvante sobre alguns antígenos candidatos à vacina6. Além disso, adjuvantes de alumínio induzem reações de hipersensibilidade mediadas por IgE5. Portanto, é necessário desenvolver novos adjuvantes para estimular uma resposta imune mais forte.
Os adjuvantes em nanoemulsão são sistemas de dispersão coloidal compostos por óleo, água, surfactantes e cosurfactantes7. Além disso, os adjuvantes são termodinamicamente estáveis e isotrópicos, podem ser autoclavados ou estabilizados por centrifugação de alta velocidade e podem ser formados espontaneamente sob condições leves de preparação. Vários adjuvantes de emulsão (como MF59, NB001-002 series, AS01-04 series, etc.) estão atualmente no mercado ou em fase de pesquisa clínica, mas seus tamanhos de partículas são superiores a 160 nm8. Portanto, as vantagens das preparações medicinais em nanoescala (1-100 nm) (ou seja, grande área de superfície específica, tamanho de partícula pequeno, efeito de superfície, alta energia de superfície, efeito de tamanho pequeno e efeito de tunelamento macroquântico) não podem ser totalmente exploradas. No presente protocolo, um novo adjuvante baseado na tecnologia de nanoemulsão com um tamanho de diâmetro de 1-100 nm foi relatado como exibindo boa atividade adjuvante9. Testamos a proteína de antígeno vacinal de subunidade de recombinação HI (α-hemolisina mutante [Hla] e fator determinante de superfície do íon Fe B [IsdB] subunidade N2 proteína de fusão de fragmento ativo); Uma série de procedimentos foi estabelecida para examinar as propriedades físicas e a estabilidade, avaliar sua resposta específica de anticorpos após administração intramuscular e testar o efeito protetor da vacina usando um modelo de infecção sistêmica em camundongos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A IsdB, uma proteína de superfície bacteriana ancorada na parede celular e regulada pelo ferro, desempenha um papel importante no processo de obtenção do ferro heme15. A Hla, toxina alfa, está entre as toxinas bacterianas mais eficazes conhecidas em MRSA, podendo formar poros em células eucarióticas e interferir na adesão e nas células epiteliais16. Em nosso estudo, uma nova proteína antigênica (HI) de MRSA de recombinação foi construída e ex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo No. 2021YFC2302603 do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China, No. 32070924 e 32000651 do NSFC, e No. 2019jcyjA-msxmx0159 do Programa de Projeto da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing.
Materials
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
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