Summary
Questo studio descrive i passaggi per ottenere immagini ad alta risoluzione del cervello di topo neonatale combinando la micro-tomografia computerizzata (micro-CT) e un agente di contrasto in campioni ex vivo . Descriviamo le analisi morfometriche di base per quantificare le dimensioni e la forma del cervello in queste immagini.
Abstract
Le neuroimmagini sono uno strumento prezioso per studiare la morfologia del cervello in esperimenti che utilizzano modelli animali. La risonanza magnetica per immagini (MRI) è diventata il metodo standard per i tessuti molli, anche se la sua bassa risoluzione spaziale pone alcuni limiti per i piccoli animali. In questo articolo, descriviamo un protocollo per ottenere informazioni tridimensionali (3D) ad alta risoluzione su cervelli e crani di topi neonati utilizzando la micro-tomografia computerizzata (micro-CT). Il protocollo include quei passaggi necessari per sezionare i campioni, colorare e scansionare il cervello e ottenere misurazioni morfometriche dell'intero organo e delle regioni di interesse (ROI). L'analisi delle immagini include la segmentazione delle strutture e la digitalizzazione delle coordinate dei punti. In sintesi, questo lavoro dimostra che la combinazione di micro-CT e soluzione di Lugol come agente di contrasto è un'alternativa adatta per l'imaging del cervello perinatale di piccoli animali. Questo flusso di lavoro di imaging ha applicazioni nella biologia dello sviluppo, nella biomedicina e in altre scienze interessate a valutare l'effetto di diversi fattori genetici e ambientali sullo sviluppo del cervello.
Introduction
L'imaging con tomografia microcomputerizzata (micro-CT) è uno strumento prezioso per diversi campi di ricerca. In biologia, è particolarmente adatto per la ricerca sulle ossa a causa dell'assorbimento dei raggi X nei tessuti mineralizzati. A causa di questa caratteristica, diverse questioni riguardanti lo sviluppo osseo1, il metabolismo2 e l'evoluzione 3,4, tra gli altri argomenti, sono state affrontate con l'assistenza della micro-TC. Nel 2008, de Crespigny et al.5 hanno dimostrato che le immagini micro-CT di cervelli adulti di topi e conigli potevano essere ottenute utilizzando lo iodio come agente di contrasto. Questo lavoro ha aperto una nuova applicazione per questa tecnica di imaging, poiché lo iodio ha permesso l'acquisizione di immagini da tessuti molli che altrimenti sarebbero stati insensibili ai raggi X. Pertanto, l'obiettivo generale della combinazione di micro-TC e di un mezzo di contrasto a base di iodio è quello di ottenere immagini ad alta risoluzione, in cui i tessuti molli possano essere distinti e identificati a livello meso o macro anatomico.
Questa tecnica ha un notevole potenziale per studi che richiedono una dettagliata caratterizzazione fenotipica ex vivo di piccoli campioni, come gli embrioni di topo, che sono ampiamente utilizzati nei disegni sperimentali6. Il mezzo di contrasto con iodio in combinazione con l'imaging micro-CT è stato utilizzato per ottenere quantificazioni volumetriche degli organi7 e delle strutture tridimensionali (3D)di riferimento 8,9. Negli ultimi anni, la scansione micro-CT di campioni colorati è stata applicata per descrivere le caratteristiche fenotipiche cerebrali dei roditori10 e sono stati proposti diversi miglioramenti alla tecnica. Per i cervelli adulti, un protocollo di 48 ore di immersione nello iodio, con una precedente fase di perfusione con un idrogel, è risultato produrre immagini di alta qualità11. Gignac et al.12 hanno ampliato i limiti di questa tecnica dimostrando che i cervelli di ratto colorati con iodio potevano essere processati per eseguire tecniche istologiche di routine. Allo stesso modo, queste procedure dimostrano risultati promettenti per i cervelli di roditori embrionali e pre-svezzamento 8,13,14,15.
Sebbene le neuroscienze abbiano ampiamente applicato tecniche basate sul microscopio per valutare diversi aspetti strutturali e funzionali dello sviluppo del cervello, tali studi sono più adatti per caratterizzare specifiche popolazioni cellulari o strutture spazialmente limitate. Al contrario, l'imaging micro-CT consente la descrizione di intere strutture e l'acquisizione di modelli 3D che conservano informazioni spaziali rilevanti, complementari alle tecniche microscopiche. La risonanza magnetica per immagini (MRI) è anche una tecnica standard applicata per esplorare le caratteristiche strutturali dei piccoli animali 16,17,18. Tuttavia, la micro-CT, con l'uso di un mezzo di contrasto, presenta due vantaggi principali per i campioni fissi ex vivo: gli scanner micro-CT sono in gran parte meno costosi e facili da usare, e consentono una risoluzione spaziale più elevata rispetto alla MRI12.
Questo lavoro ha lo scopo di descrivere la procedura per ottenere immagini ad alta risoluzione dal cervello di topo neonatale utilizzando la scansione micro-CT dopo la colorazione con la soluzione di Lugol, un agente di contrasto a base di iodio. Viene presentato un protocollo completo, che inizia con le fasi preliminari come la raccolta del campione e la fissazione dei tessuti, e passa attraverso la colorazione, l'acquisizione di immagini micro-CT e l'elaborazione standard. L'elaborazione delle immagini include la segmentazione di un volume 3D dell'intera testa, così come del cervello, e la selezione di piani anatomici specifici per digitalizzare le coordinate dei punti che potrebbero poi essere utilizzate nelle analisi morfometriche. Sebbene l'attenzione si concentri sul cervello neonatale del topo, strategie simili possono essere applicate ad altri tessuti molli. Pertanto, il protocollo qui presentato è abbastanza flessibile da poter essere applicato, con lievi modifiche, ad altri tipi di campioni.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali hanno seguito le linee guida del Canadian Council on Animal Care.
1. Raccolta e preparazione dei campioni
- Preparare 500 ml di paraformaldeide (PFA) al 4%.
- Sotto un flusso di estrazione in un armadio, aggiungere 20 g di polvere di PFA a 250 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un becher di vetro da 1 L. Posizionare il becher con un magnete su una piastra magnetica per mescolare.
- Mescolare mentre si riscalda. Con un termometro, controllare costantemente la temperatura della soluzione per mantenerla al di sotto dei 60 °C.
- Con una pipetta Pasteur di plastica, aggiungere gocce di 1 M di NaOH alla soluzione per sciogliere il PFA. Una volta che la polvere di PFA si è completamente sciolta, raffreddare la soluzione a temperatura ambiente (RT).
- Regolare il volume a 500 mL con 1x PBS. Regolare il pH a 7,2-7,3 aggiungendo gocce di HCl 1 M con una pipetta Pasteur di plastica.
- Utilizzando un filtro di carta e un imbuto di vetro, filtrare la soluzione in un flacone di vetro da 1 L.
- Chiudere il flacone di vetro, rimuoverlo dall'armadietto e conservare in frigorifero a -4 °C.
- Raccogli campioni di cervello.
- Per ottenere i campioni, sacrificare i neonati di topo la mattina successiva alla loro nascita, a 0,5 giorni di età (P 0,5), usando forbici chirurgiche per decapitarli.
- Posiziona le forbici nel collo del neonato tenendo il corpo ed esegui un taglio unico e netto.
- Fissare i campioni in PFA.
- Riempire una provetta conica da 50 mL con 40 mL di PFA al 4%.
- Immergere ciascuna testina nel tubo contenente PFA come agente di fissaggio. Per questa azione, utilizzare una spatola Paton o un cucchiaio.
- Conservare le provette coniche in frigorifero a -4 °C per 48 ore, quindi passare a 40 mL di 1x PBS con 0,1% di sodio azide come conservante. Conservare in frigorifero a -4 °C.
2. Colorazione del campione
- Preparare la soluzione di Lugol (3,75% p/v).
- Sotto un flusso di estrazione in un armadio, in un becher di vetro da 1 L, sciogliere 10 g di Kl e 5 g di I2 in 400 mL di acqua distillata, mescolando costantemente utilizzando un agitatore magnetico.
- Immergere ogni testa in una provetta conica da 50 mL contenente 40 mL di soluzione di Lugol.
- Per i neonati di dimensioni corporee approssimative di 1,3 g, lasciare i campioni immersi per 15-20 ore con una miscelazione costante utilizzando un agitatore orbitale.
- Mettere i campioni in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di agarosio all'1% per 30 minuti prima della scansione.
3. Scansione micro-CT
NOTA: La scansione Micro-CT richiede un'attrezzatura specifica. Esistono diverse opzioni per questo tipo di scanner e i dettagli sull'acquisizione dipendono dalle caratteristiche dell'attrezzatura utilizzata. Il laboratorio del Dr. Hallgrímsson conta su alcune alternative di scanner micro-CT. In questo caso, il protocollo si basa sull'uso di uno scanner desktop di base, che è tra le macchine per l'imaging di piccoli animali più accessibili utilizzate dai laboratori di tutto il mondo. Se l'obiettivo della scansione è il cranio, saltare i passaggi della sezione 2 del protocollo e procedere alla sezione 3. Dopo la scansione del cranio, è stato possibile eseguire il processo di colorazione e la scansione del cervello per ottenere immagini dagli stessi campioni sia del cervello che del cranio.
- Collocare il campione nel supporto per micro-CT.
- Mettere il campione in una provetta conica da 50 ml. Fissare il campione per evitare movimenti durante la sessione di scansione. A tale scopo, è possibile utilizzare del materiale poliuretanico per riempire le parti vuote del tubo.
- Aprire l'apparecchiatura e posizionare la provetta con il campione nel supporto per micro-CT.
- Accedere al pannello di controllo micro-CT e registrare il campione da scansionare. In questo modo verrà generato automaticamente un numero di campioni. Oltre al numero, compila il campo "Nome". Sia il nome che il numero del campione devono essere registrati altrove (ad esempio, in un foglio di calcolo) nel caso in cui i dati grezzi debbano essere recuperati nuovamente.
- Avviare il programma di scansione. Immettere il nome o il numero del campione e selezionare un file di controllo , che deve contenere i parametri di scansione.
- Eseguire la scansione del campione.
- Nella schermata del software micro-CT, impostare i seguenti parametri: dimensione del voxel isotropo di 0,012 mm, 45 kVp, 177 lA, tempo di integrazione di 800.000 ms e 500 proiezioni per 180°.
- Impostare l'area di scansione selezionando Vista esplorazione. Una volta visualizzata l'immagine di riferimento, premere Linea di riferimento per impostare la regione. Spostare la linea verde continua sul bordo del campione, quindi tenere premuto Maiusc mentre si trascina il cursore per estendere l'area di scansione all'altro bordo del campione.
- Selezionare OK per avviare la scansione.
- Valutare ed esportare la scansione.
- Aprire il programma di valutazione dello scanner micro-CT e fare clic su Seleziona campione e misurazione. Nel campo Filtro , digitare il nome del campione, selezionare il campione e selezionare il file di misurazione.
- Il file verrà caricato come sezioni, il cui numero dipende dalla finestra di scansione iniziale. Fare clic sul pulsante Carica tutto , che caricherà ogni fetta e faciliterà lo spostamento tra le fette in un secondo momento.
- Selezionare Attività > Valutazione 3D per inizializzare un riquadro di ritaglio attorno alle sezioni. Verrà visualizzato un prompt Valutazione 3D con una serie di campi, tra cui Attività/Valutazione, VOI (Volume di interesse), Inizio X, Y, Z e Dimensione X, Y, Z.
- Impostare il campo Attività > valutazione 3D sullo script appropriato, in quanto è possibile eseguire una serie di attività di valutazione, come la ricostruzione, la segmentazione, la morfometria (ad esempio, la densità minerale ossea) e le conversioni o i trasferimenti di file. Lo script di valutazione predefinita può essere utilizzato come guida.
- Dopo aver selezionato lo script, regolare la casella VOI sull'immagine principale. Iniziare dalla prima fetta. Assicurarsi che la scatola contenga l'anatomia da valutare. Sposta il VOI facendo clic con il pulsante destro del mouse su uno dei quadratini bianchi verso il bordo della casella e ridimensionando il VOI utilizzando il pulsante centrale del mouse. In alternativa, modificare numericamente i campi Dimensione .
- Passare attraverso il campione utilizzando la barra di scorrimento sotto l'immagine per assicurarsi che tutte le anatomie siano state catturate nella casella VOI. Fare clic su XY, XZ o YZ in alto a sinistra del software per modificare l'orientamento.
- Selezionare Avvia valutazione. A seconda dello script di valutazione dell'attività, verrà generato un file di immagine .aim 3D con un file di intestazione .txt corrispondente. Inoltre, è possibile specificare nello script un percorso FTP (File Transfer Protocol) per l'immagine in una determinata posizione.
4. Elaborazione delle immagini
- Aprire le immagini nel software di elaborazione delle immagini.
NOTA: L'elaborazione delle immagini può essere eseguita utilizzando vari software. Questo protocollo include i passaggi di base in un software commerciale, che è ampiamente accettato nell'area e dispone di strumenti versatili per l'elaborazione di base e avanzata. Inoltre, ci sono diversi formati accettabili per le immagini micro-CT ricostruite. Questo aspetto di solito dipende dall'apparecchiatura utilizzata per l'acquisizione e dal suo software. In questo caso, l'elaborazione delle immagini viene eseguita con immagini .bmp. La stessa procedura può essere applicata per .tiff immagini e altri tipi. Poiché l'acquisizione viene eseguita in uno scanner con .aim come formato predefinito, viene prima presentata una conversione da .aim a .bmp.- Per aprire i file .aim, selezionare File > Apri dati e scegliere il file. Successivamente, si aprirà una finestra con il titolo Selezione formato file. Selezionare Dati non elaborati.
- Si aprirà una finestra con il titolo Parametri dati grezzi. In questa finestra, compilare i parametri seguendo le informazioni sull'intestazione .txt file generato per ogni file .aim. Per Tipo di dati, scegliere 16 bit per l'intestazione completa del numero dopo l'inizio dei dati dell'immagine in corrispondenza dell'offset di byte. Inoltre, imposta le dimensioni e la dimensione del voxel utilizzando le informazioni sull'intestazione .txt file. Una volta completati i parametri, premere OK.
- Se è necessaria la conversione da .aim a .bmp, nel pannello principale > nella vista Progetto, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto .aim e selezionare l'opzione Converti > Converti tipo immagine. In Proprietà selezionare 8 bit come Tipo di output. Seleziona Applica.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nuovo oggetto a 8 bit. Seleziona Salva con nome. Scegli .bmp e salva.
- Per aprire il file .bmp, selezionare File > Apri dati e scegliere il file. Successivamente, si apre una finestra con i parametri dell'immagine. Confermare i parametri e accettarli se corretti.
- Nel pannello Principale > nella vista Progetto, viene creato un nuovo oggetto con il nome dei file .bmp. Fare clic con il pulsante destro del mouse su questo oggetto e selezionare l'opzione Orto sezione. In Proprietà, selezionare il numero di sezione e il piano di orientamento da visualizzare.
- Ottenere volumi 3D dell'intera testa.
- Nel pannello principale > nella vista Progetto, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto immagine. Selezionare l'opzione Soglia interattiva > Crea. In Proprietà, modificare i valori di RGB minimo e RGB massimo fino a selezionare la parte dell'immagine corrispondente alla testa dell'animale. Seleziona Applica.
- Nel pannello principale > nella vista Progetto, viene creato un oggetto con soglia. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto e, in Proprietà, selezionare Isosuperficie. In Proprietà, scegliere una soglia per visualizzare la superficie e fare clic su Applica. Questa soglia deve essere scelta empiricamente, quindi potrebbe essere necessario esaminare valori diversi.
- Digitalizzazione delle coordinate dei punti
- Le coordinate dei punti 3D possono essere digitalizzate sia in base alle fette che alle superfici estratte. Per la prima opzione, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'opzione immagine e selezionare Sezione. In Traslazione, scegliere la sezione desiderata nel piano assiale. Se il piano non è posizionato correttamente, fare clic su Opzioni > Ruota in Proprietà per stabilire l'orientamento corretto.
- Per digitalizzare i punti di riferimento, fare clic con il pulsante destro del mouse nel pannello principale > vista progetto e selezionare Crea oggetto > punti e linee > punti di riferimento. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui nuovi punti di riferimento dell'oggetto e selezionare Vista punto di riferimento. In Vista punto di riferimento, modificare la dimensione del punto in Dimensione. Per aggiungere punti di riferimento in Proprietà, utilizzare l'opzione Aggiungi in modalità di modifica.
NOTA: Per i neonati, è stata precedentemente pubblicata una serie di punti di riferimento e semipunti di riferimento intorno alle curve assiali e sagittali del cervello14. - Per prima cosa, scegli il piano assiale che attraversa il punto più rostrale dei bulbi olfattivi e il punto più caudale della corteccia.
- Selezionare i punti di riferimento dell'oggetto e, in Proprietà, selezionare Editor punti di riferimento. Utilizzando la freccia, fare clic sul punto in cui il punto deve essere digitalizzato.
- Nell'insieme di punti di riferimento proposto, 24 punti sono digitalizzati nel piano assiale selezionato. Digitalizza il primo nel punto più caudale del cervello sulla linea mediana.
- Digitalizza cinque punti equamente distribuiti lungo la curva (semilandmarks) fino al punto di riferimento successivo all'intersezione tra il mesencefalo e la corteccia.
- Quindi, digitalizza otto punti (punti di riferimento) intorno alla corteccia.
- Digitalizza un nuovo punto di riferimento all'intersezione tra la corteccia e i bulbi olfattivi. Quindi, digitalizza quattro punti (semi-punti di riferimento) intorno ai bulbi olfattivi.
- Digitalizza un nuovo punto di riferimento nel punto più rostrale dei bulbi olfattivi sulla linea mediana. Quindi, digitalizza due punti (punti di riferimento) tra i due bulbi olfattivi.
- Digitalizza un nuovo punto di riferimento nel punto più caudale dei bulbi olfattivi sulla linea mediana.
- Per i punti sagittali, stabilire una fetta nella parte destra del cervello su un piano parasagittale dove il cervello è più caudalmente prominente.
- Nell'insieme di punti di riferimento proposto, 33 punti sono digitalizzati nel piano parasagittale selezionato. Digitalizza il primo nell'intersezione tra il diencefalo e il rombencefalo. Quindi, digitalizza nove punti (semilandmarks) nel limite ventrale del cervello.
- Digitalizza un nuovo punto di riferimento nel punto più rostrale del bulbo olfattivo. Quindi, digitalizza tre punti (semilandmark) intorno ai bulbi olfattivi.
- Digitalizza un nuovo punto di riferimento nell'intersezione tra il bulbo olfattivo e la corteccia. Quindi, digitalizza tre punti (semilandmark) intorno ai bulbi olfattivi.
- Digitalizza un nuovo punto di riferimento nell'intersezione tra il bulbo olfattivo e la corteccia. Quindi, digitalizza sette punti (semi-punti di riferimento) intorno alla corteccia.
- Digitalizza un nuovo punto di riferimento nell'intersezione tra la corteccia e il mesencefalo. Quindi, digitalizza sette punti (semi-punti di riferimento) intorno alla corteccia.
- Digitalizza un nuovo punto di riferimento nell'intersezione tra la corteccia e il mesencefalo. Quindi, digitalizza sei punti (semilandmarks) intorno al mesencefalo.
- Digitalizza un nuovo punto di riferimento nell'intersezione tra il mesencefalo e il cervelletto. Quindi, digitalizza due punti (semilandmarks) intorno al cervelletto.
- Digitalizza un nuovo punto di riferimento nell'intersezione tra il cervelletto e il rombencefalo.
- Salvare i punti digitalizzati. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui punti di riferimento dell'oggetto e scegliere l'opzione Salva dati.
- Analizza le coordinate dei punti.
NOTA: Una volta digitalizzate le coordinate del punto per un insieme di campioni, è possibile eseguire analisi di base utilizzando strumenti di morfometria geometrica per ottenere le variabili di dimensione (dimensione del centroide) e forma (forma o coordinate di Procuste). Le analisi vengono eseguite in un ambiente software aperto e gratuito, particolarmente adatto per le analisi statistiche.- Utilizzando un blocco note, costruisci un file contenente le coordinate di tutti i campioni digitalizzati. A tale scopo, seguire il formato TPS, come descritto in https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm.
- Aprire il software statistico. Selezionare File > Cambia directory per scegliere la directory in cui salvare il file .tps.
- Selezionare Pacchetti > Installa pacchetti. Scegli uno Specchio di Cran. Cerca geomorph e installalo.
- Caricare i pacchetti digitando nella console: library(geomorph) e library(Morpho).
- Caricare il dataset digitando nella console: dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID").
- Eseguire l'analisi generalizzata di Procuste digitando nella console: GPA<- gpagen(dataset).
- Ottenere la dimensione del centroide digitando nella console: CS<-GPA$Csize.
- Ottenere le coordinate di Procuste digitando nella console: ProcCoord<- GPA$coords.
- Tracciare le coordinate di Procuste e la forma media digitando nella console: plotAllSpecimens(ProcCoord).
- Segmentazione del ROI
NOTA: Per segmentare il cervello e ottenere una ricostruzione 3D, identificare manualmente i tessuti cerebrali in ogni fetta. La stessa procedura può essere applicata a ROI specifici, come i bulbi olfattivi, la corteccia, ecc.- Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pannello principale > Vista progetto e selezionare Crea oggetto > campo etichetta.
- Selezionando l'oggetto Campo etichetta , premere l'opzione Editor segmentazione in Proprietà.
- In Materiali, aggiungere un nuovo materiale e, se lo si desidera, rinominarlo come Cervello.
- In Selezione, scegliere l'opzione Sezione corrente per segmentare il tessuto corrispondente al cervello in ciascuna sezione.
- Utilizzando le opzioni presenti in Strumenti, selezionare il tessuto cerebrale in ogni sezione. Per questo caso, la bacchetta magica e il pennello sono i più adatti.
- Una volta effettuata la selezione in ogni sezione, premere Aggiungi nella selezione.
- Al termine della selezione di tutte le sezioni, tornate alla vista Progetto nel pannello principale e fate clic con il pulsante destro del mouse su Campo etichetta per selezionare Genera superficie, quindi fate clic su Applica (Apply).
- Una volta ottenuta la superficie, esportatela applicando Estrai superficie (Extract Surface).
- Per ottenere il volume delle strutture segmentate, nel Pannello Principale > nella Vista Progetto, selezionare l'oggetto che contiene l'etichetta, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Misura e analizza > frazione di volume. Quindi, fai clic su Applica.
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Representative Results
Qui viene presentato un protocollo di base per ottenere immagini ad alta risoluzione del cervello di topo neonatale. Le teste sono state scansionate dopo l'immersione nella soluzione di Lugol. Nonostante le loro piccole dimensioni, è possibile distinguere le principali strutture anatomiche cerebrali, come i bulbi olfattivi, la corteccia, il mesencefalo, il cervelletto e il rombencefalo (Figura 1).
Diverse analisi possono essere eseguite utilizzando queste immagini come input. Sono stati digitalizzati una serie di punti di riferimento e semipunti di riferimento in due diversi piani anatomici. Come si può osservare nella Figura 2, i punti sono posizionati lungo tutto il bordo del cervello in corrispondenza dei piani scelti. Una volta terminata la digitalizzazione, le coordinate dei punti possono essere lette in un file .txt (Figura 3). Lo scopo della digitalizzazione dei punti era quello di ottenere coordinate grezze che potessero essere ulteriormente utilizzate nelle analisi morfometriche geometriche. Il protocollo presentato è focalizzato su un singolo campione e le analisi morfometriche sono adatte per campioni più grandi, ma i risultati ottenuti utilizzando lo stesso set di punti sono presentati altrove14.
Infine, il risultato della segmentazione manuale dell'intero cervello è un modello 3D del cervello (Figura 4). In questi volumi è possibile adottare diversi approcci, dalla semplice stima dell'area e del volume all'estrazione di punti di superficie, fino all'esecuzione di analisi simili a quella presentata qui per i punti di curva.
Figura 1: Sezioni rappresentative di un'immagine micro-TC della testa di un neonato. Vengono presentati i piani assiali, (D) coronali e (E) parasagittali. Regioni e strutture che possono essere distinte nel piano parasagittale: (a) bulbi olfattivi, (b) corteccia, (c) mesencefalo, (d) cervelletto, (e) rombencefalo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Punti di riferimento e semipunti di riferimento digitalizzati nel protocollo proposto. (A) Vengono presentati i piani assiali e (B) parasagittali. I numeri indicano i punti di riferimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempio di un file contenente le coordinate dei punti esportate dal software. Sono indicati gli elementi principali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Ricostruzione 3D del cervello di un neonato dopo la segmentazione manuale. Un esempio di un intero cervello ricostruito è presentato in due viste. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo lavoro, viene introdotto un protocollo conciso per la scansione dei tessuti cerebrali neonatali di topi utilizzando la micro-TC con un agente di contrasto. Inoltre, include procedure semplici per ottenere risultati quantitativi e qualitativi. Sulla base di questi metodi, è possibile eseguire ulteriori analisi alternative o complementari.
Come mostrato nel protocollo, le immagini micro-CT possono essere analizzate in diversi modi. In studi precedenti, il nostro gruppo ha stimato la variazione delle dimensioni e della forma nel cervello perinatale dei topi digitalizzando le coordinate dei punti e applicando tecniche morfometriche geometriche 8,14. La digitalizzazione delle coordinate è utile anche per ottenere misure lineari, utilizzando una semplice stima della distanza euclidea. Questo, insieme ai volumi derivati dalle segmentazioni cerebrali e ROI, sono input preziosi per la valutazione morfometrica tradizionale.
Sebbene il protocollo qui presentato sia facilmente applicabile a piccoli campioni ex vivo , come quelli che abbiamo usato, non è applicabile per gli studi in vivo , poiché la fissazione, e in particolare la soluzione di Lugol come agente di contrasto, non è praticabile. L'imaging micro-CT viene utilizzato in vivo, di solito per l'esame dei tessuti duri19, ma la somministrazione di mezzi di contrasto che raggiungono il cervello attraversando la barriera ematoencefalica nei neonati viventi non è semplice. Pertanto, la tecnica qui presentata è ancora uno strumento promettente per rispondere a diverse domande di variazione morfologica.
Poiché studi pionieristici hanno dimostrato che lo iodio è una buona scelta per gli embrioni di vertebrati20, la sua applicazione si è espansa rapidamente ed è diventato evidente che uno dei principali inconvenienti di questa tecnica è il restringimento prodotto dal mezzo di contrasto12. Si tratta di un problema onnipresente negli studi che utilizzano questo approccio, e gli utenti dovrebbero tenerne conto quando riproducono il protocollo qui presentato, poiché è prevista una certa quantità di restringimento. Sono state proposte diverse strategie per ridurre questo effetto; Vickerton et al.21 hanno esaminato diverse concentrazioni di iodio e hanno concluso che il restringimento dipende direttamente dalla concentrazione e la sua riduzione aiuta in gran parte a frenare la deformazione dovuta a questo effetto. Un altro punto da regolare è il giusto tempo di immersione, che dipende dalle dimensioni e dalla durezza delle strutture. Dopo alcuni test, abbiamo scoperto che 15-20 ore sono un periodo sufficiente per colorare i tessuti cerebrali dei neonati di topo e preservarne le principali proprietà morfologiche. Alcuni autori hanno suggerito l'uso di alcune soluzioni prima della colorazione, come l'agarosio7 e l'idrogel11,13, oppure l'applicazione di una soluzione tamponata di Lugol che previene l'acidificazione e, di conseguenza, il restringimento22. Tutte queste procedure potrebbero essere aggiunte al protocollo qui presentato, che è un approccio generale e di base all'imaging micro-CT con contrasto di iodio.
L'uso di scanner micro-CT per l'imaging dei tessuti molli in campioni più grandi, come i topi adulti, presenta alcuni inconvenienti. Una procedura di immersione per la colorazione non è raccomandabile perché la distribuzione del mezzo di contrasto sarà probabilmente eterogenea. Sarà importante esplorare alcune opzioni alternative, come la somministrazione della soluzione di Lugol attraverso la perfusione cardiaca.
In conclusione, la micro-TC con l'aggiunta della soluzione di Lugol è un'alternativa adatta per l'imaging del cervello perinatale di piccoli animali, in particolare topi. Si tratta di un modo semplice per ottenere immagini ad alta risoluzione che, integrate con l'istologia, possono fornire una caratterizzazione coerente della variazione morfologica del cervello.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Wei Liu per la sua assistenza tecnica. Questo lavoro è finanziato da ANPCyT PICT 2017-2497 e PICT 2018-4113.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
References
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