C. elegans Çim Önleme Testi için Akıllı Telefon Tabanlı Bir Görüntüleme Yöntemi
Summary
Bu makalede, Caenorhabditis elegans’ın çimden kaçınma davranışını, akıllı telefon ve ışık yayan diyot (LED) ışık kutusu gibi hazır bulunan öğeleri kullanarak kaydetmenin basit, düşük maliyetli bir yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, video dosyasını saymaya daha uygun bir formatta işlemek için bir Python betiği de sağlıyoruz.
Abstract
Toksik veya patojenik bakterilere maruz kaldığında, nematod Caenorhabditis elegans , solucanların yavaş yavaş besin kaynaklarını terk ettiği ve bakteriyel çimlerin dışında kalmayı tercih ettiği öğrenilmiş bir çimden kaçınma davranışı sergiler. Tahlil, solucanların zararlı koşullara uygun şekilde yanıt vermek için dış veya iç ipuçlarını algılama yeteneğini test etmenin kolay bir yoludur. Basit bir tahlil olmasına rağmen, özellikle birden fazla numunede sayma zaman alıcıdır ve bir gecede yayılan tahlil süreleri araştırmacılar için elverişsizdir. Uzun bir süre boyunca birçok plakayı görüntüleyebilen bir görüntüleme sistemi kullanışlıdır ancak maliyetlidir. Burada, C. elegans’ta çimlerden kaçınmayı kaydetmek için akıllı telefon tabanlı bir görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Yöntem, iletilen bir ışık kaynağı olarak hizmet etmek için yalnızca bir akıllı telefon ve ışık yayan diyot (LED) ışık kutusu gerektirir. Boş hızlandırılmış kamera uygulamalarını kullanarak, her telefon çim dışındaki solucanları manuel olarak saymak için yeterli keskinlik ve kontrastla altı plakaya kadar görüntü görüntüleyebilir. Elde edilen filmler, her saatlik zaman noktası için 10 s sesli video ara bırakma (AVI) dosyalarına işlenir, daha sonra saymaya daha uygun hale getirmek için her bir plakayı göstermek üzere kırpılır. Bu yöntem, kaçınma kusurlarını incelemek isteyenler için uygun maliyetli bir yoldur ve potansiyel olarak diğer C. elegans tahlillerine genişletilebilir.
Introduction
C. elegans’ı incelemenin birçok avantajı arasında, basit sinir sistemi, genetik ve hücresel düzeydeki değişikliklerin ağ fonksiyonunu ve davranışsal çıktıyı nasıl etkilediğini inceleme fırsatı sunar. Sınırlı sayıda nörona sahip olmasına rağmen, C. elegans çok çeşitli karmaşık davranışlar sergiler. Bunlardan biri, bakterivor nematodun bakteriyel çimleri terk ederek zararlı bir besin kaynağına tepki verdiği çimlerden kaçınmadır. C. elegans, patojenik bakteri 1,2,3 çimlerinden, toksin üreten veyatoksinlerle çivilenmişbakteri çimlerinden 1,4 ve hatta hedef gen yıkımı solucanların sağlığına zararlı olan RNAi eksprese eden bakterilerden kaçınır 4,5. Çalışmalar, solucanların patojenik bakteriler 1,6 tarafından üretilen metabolitler gibi dış ipuçlarına veya yiyeceğin onları hasta ettiğini gösteren iç ipuçlarına yanıt verdiğini göstermiştir 4,7. Bu ipuçları, mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz (MAPK) yolu ve dönüştürücü büyüme faktörü beta (TGFβ) yolu gibi korunmuş sinyal yolları aracılığıyla işlenir ve bağırsak ile sinir sistemi arasında iletişim gerektirir 4,6,7,8.
Tahlil basit olmasına rağmen, öğrenilen davranış genellikle bir gecede saatlerce gelişir. Ayrılamayan mutantlar olsa da, bu durumda sadece bir zaman noktasında kaçınma puanlaması kusuru göstermek için yeterlidir, birçok mutant sonunda ayrılır, ancak ortaya çıkması daha yavaştır. Bunlar için, solucanların hareketinin birkaç saatte bir izlenmesi gerekir, bu da gece boyunca yapılması zor olabilir. Saymanın kendisi de zaman alır, plakalar arasında bir gecikme süresi yaratır ve böylece aynı anda test edilebilecek plaka sayısını sınırlar. Tahlilin tüm süresi boyunca aynı anda birçok plakayı kaydetmek için bir görüntüleme kurulumu kullanmak çok yararlı olacaktır, ancak araştırma laboratuvarının finansman durumuna bağlı olarak kurulum maliyeti engelleyici olabilir.
Bunu ele almak için, kaçınma testlerini kaydetmek için akıllı telefonları kullanan çok basit bir yöntem geliştirdik. Her telefon, altı adede kadar tahlil plakasının hızlandırılmış videolarını kaydedebilir. İletilen ışığı sağlamak için, çevrimiçi olarak kolayca satın alınabilen bir ışık yayan diyot (LED) ışık kutusu kullanıyoruz. Tahlil plakaları, gelen ışığı odaklayan ve kontrast yaratan içi boş dikdörtgen tünellerle desteklenen yükseltilmiş bir platforma yerleştirilir. Ayrıca, videoları her saatlik zaman noktasının 10 s klibini gösteren sesli video ara bırakma (AVI) dosyalarına dönüştüren bir Python komut dosyası da sağlıyoruz. Videolar daha sonra ayrı ayrı plakalara kırpılır ve manuel sayım için kullanılmak üzere ayrı dosyalara kaydedilir.
Bu yöntem, çoğu insan için hazır olan öğeleri kullanarak, kullanımı da son derece kolay olan düşük maliyetli bir prosedür sağlar. Burada, protokolü daha önce 2,9 olarak tanımlanan insan patojeni Pseudomonas aeruginosa’ya (PA14) karşı köklü çim önleme testini kullanarak yöntemi açıklıyoruz. Son olarak, görüntüleme yöntemini diğer C. elegans davranış deneylerine uygulamak isteyenler için dikkat edilmesi gereken hususları ve sınırlamaları da gözden geçiriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doğrudan gözleme dayanmak yerine hayvan davranışlarını görüntülemek, sadece uygun değil, aynı zamanda görsel dokümantasyon bırakma avantajına da sahiptir. Bu, objektif bir üçüncü kişi tarafından kör analize izin verir veya görüntü tanıma tekniklerini kullanarak otomatik analiz için bile kullanılabilir. Avantajlara rağmen, genellikle sunulan standart ekipmanın maliyeti yüksektir, bu nedenle satın alındıktan sonra kuruluma bağlı kalınır.
Basit C. elegans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deok Joong Lee’ye yazıyı eleştirel bir şekilde okuduğu ve Python kodunu test ettiği için teşekkür ederiz. Bu araştırma Kore Ulusal Araştırma Vakfı 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) ve 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
