작은 절지동물에서 체림프를 수집하기 위한 정확하고 정량화 가능한 방법
Summary
우리는 후속 분석을 위해 작은 절지동물에서 정량화 가능한 혈림프를 효율적으로 수집하는 방법을 설명합니다.
Abstract
절지동물은 바이러스 전파에 필수적인 혈림프를 통해 의료 및 농업적으로 중요한 다양한 바이러스를 전염시키는 것으로 알려져 있습니다. 체액 채취는 바이러스-벡터 상호작용을 연구하기 위한 기본 기술입니다. 여기에서는 이 절지동물이 벼 줄무늬 바이러스(RSV)의 주요 매개체이기 때문에 연구 모델로 Laodelphax striatellus (작은 갈색 식물 호퍼, SBPH)를 사용하여 작은 절지동물에서 체림프를 정량적으로 수집하는 새롭고 간단한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서 과정은 끝이 가는 핀셋으로 얼어붙은 절지동물의 한쪽 다리를 부드럽게 꼬집고 상처에서 혈림프를 밀어내는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 모세관과 피펫 전구로 구성된 간단한 마이크로 피펫을 사용하여 모세관 힘의 원리에 따라 상처에서 수혈 성 혈림프를 수집합니다. 마지막으로, 수집된 체액은 추가 연구를 위해 특정 완충액에 용해될 수 있습니다. 작은 절지동물에서 체림프를 수집하는 이 새로운 방법은 아르보 바이러스 및 벡터-바이러스 상호 작용에 대한 추가 연구를 위한 유용하고 효율적인 도구입니다.
Introduction
동물과 식물 바이러스는 모두 절지 동물에 의해 전염 될 수 있으며,이 바이러스는 인체 건강에 심각한 위협이되며 농업에서 엄청난 경제적 손실을 초래합니다 1,2,3. 중요한 것은 절지동물의 순환계이자 면역계의 중요한 요소 역할을 하는 절지동물 혈림프가 아르보바이러스 전파를 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것입니다. 절지동물의 내장을 통해 획득된 바이러스는 불리한 혈림프 환경을 성공적으로 탈출한 후에만 다른 조직으로 운반된다 4,5,6,7. 절지 동물 혈림프에서 바이러스의 수명주기는 유체 혈장에서의 바이러스 생존, 혈구로의 진입 및 다른 조직으로의 수송을 포함하며, 다양한 바이러스 – 벡터 상호 작용 메커니즘이 혈림프에서 발생합니다 8,9,10,11,12. 예를 들어, SBPH에 의한 RSV의 수직 투과는 SBPH 비텔로제닌 단백질과 RSV(rice stripe virus) 캡시드 단백질 사이의 분자 상호작용에 의존한다(13,14). 일부 바이러스는 특정 벡터 인자15,16,17,18에 결합하여 체림프의 면역 반응을 피할 수 있습니다. 따라서 절지동물의 체액에서 벡터-바이러스 상호작용을 조사하는 것은 아르보 바이러스 전파에 대한 더 나은 이해를 개발하는 데 중요합니다.
planthoppers, leafhoppers 및 일부 모기와 같은 일부 작은 곤충의 체액은 크기 때문에 수집하기가 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해 주사기 바늘을 곤충 몸에 직접 삽입하여 미세량의 체액을 추출하고, 끝이 가는 핀셋으로 상처 부위에서 삼출물을 수집하고, 직접 원심분리하는 등 체액을 수집하는 여러 방법이 개발되었습니다. 이러한 방법은 혈림프내의 상대적 유전자 발현 수준 및 바이러스 역가의 측정을 가능하게 했습니다 19,20,21. 그러나 혈구 계수, 단백질 정량 및 효소 활성 분석에 필요한 체액 림프량을 정량화하는 효과적인 방법은 현재 이러한 작은 곤충에 대해 사용할 수 없습니다.
SBPH (작은 갈색 planthopper)는 몸 길이가 약 2-4 mm 인 작은 곤충 벡터의 일종입니다. SBPH는 RSV, 옥수수 거친 난쟁이 바이러스 및 쌀 검은 줄무늬 난쟁이 바이러스22,23,24를 포함한 다양한 식물 바이러스를 전염시킬 수 있습니다. SBPH와 RSV 간의 상호 작용은 지난 10년 동안 심층적으로 연구되었습니다. SBPH 작업을 용이하게 하기 위해 우리는 혈림프를 수집하는 새롭고 간단한 방법을 개발했습니다. 모세관력의 원리를 기반으로 하는 이 방법은 눈금 표시가 있는 모세관을 사용하여 곤충의 체림프를 정확하고 정량화할 수 있는 방식으로 획득합니다. 이를 통해 작은 곤충에서 특정 부피의 체액을 효율적으로 수집하고 작은 벡터의 체액 림프 환경을 더 자세히 연구 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
혈림프는 절지동물의 순환계의 매개체이며, 아르보 바이러스는 적대적인 혈림프 환경에서 생존할 수 있는 경우에만 다른 절지동물 조직을 침범할 수 있습니다. 고품질 혈림프 샘플을 수집하는 것은 혈림프에서 발생하는 벡터-바이러스 상호 작용을 연구하는 첫 번째 단계입니다. 곤충 체액은 앞다리의 상처, 머리 부위의 경미한 절개 또는 복부의 찢어진 상처를 포함하여 곤충의 몸의 여러 부위에?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(No. 2022YFD1401700)과 중국 국가과학재단(No. 32090013 및 No. 32072385)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
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