Диссекция и выделение регионоспецифической децеллюляризированной ткани легких
Summary
Здесь представлен протокол выделения регионарной децеллюляризированной легочной ткани. Этот протокол предоставляет мощный инструмент для изучения сложностей во внеклеточном матриксе и взаимодействиях между клетками и матриксом.
Abstract
Трансплантация легких часто является единственным вариантом для пациентов на поздних стадиях тяжелого заболевания легких, но это ограничено как из-за наличия подходящих донорских легких, так и из-за острого и хронического отторжения после трансплантации. Определение новых биоинженерных подходов для замены больных легких является обязательным условием для повышения выживаемости пациентов и предотвращения осложнений, связанных с текущими методологиями трансплантации. Альтернативный подход включает использование децеллюляризированных целых легких, в которых отсутствуют клеточные компоненты, которые, как правило, являются причиной острого и хронического отторжения. Поскольку легкое является таким сложным органом, представляет интерес изучение компонентов внеклеточного матрикса конкретных областей, включая сосудистую сеть, дыхательные пути и альвеолярную ткань. Целью этого подхода является создание простых и воспроизводимых методов, с помощью которых исследователи могут препарировать и изолировать регионоспецифическую ткань от полностью децеллюляризированных легких. Текущий протокол был разработан для легких свиней и человека, но может быть применен и к другим видам. Для этого протокола были определены четыре области ткани: дыхательные пути, сосудистая сеть, альвеолы и объемная легочная ткань. Эта процедура позволяет получить образцы ткани, которые более точно представляют содержимое децеллюляризированной легочной ткани, в отличие от традиционных методов объемного анализа.
Introduction
Заболевания легких, включая хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) и муковисцидоз (МВ), в настоящее время остаются неизлечимыми 1,2,3,4. Трансплантация легких часто является единственным вариантом для пациентов на более поздних стадиях, однако она остается ограниченным вариантом как из-за наличия подходящих донорских легких, так и из-за острого и хронического отторжения после трансплантации 3,5,6. Таким образом, существует острая потребность в новых стратегиях лечения. Одним из перспективных подходов в респираторной биоинженерии является применение тканевых каркасов, приготовленных из децеллюляризованной нативной ткани легких. Поскольку бесклеточные цельные каркасы легких сохраняют большую часть сложности состава и биологической активности нативного внеклеточного матрикса (ECM), они интенсивно изучались для цельноорганной инженерии и в качестве улучшенных моделей для изучения механизмов заболеваний легких 7,8,9,10. Параллельно растет интерес к использованию децеллюляризированных тканей из различных органов, включая легкие, в качестве гидрогелей и других субстратов для изучения межклеточных и клеточно-ECM-взаимодействий в органоидных и других моделях тканевых культур 11,12,13,14,15,16,17 . Они предоставляют более релевантные модели, чем коммерчески доступные субстраты, такие как Matrigel, полученные из опухолевых источников. Однако информация о гидрогелях человеческого происхождения в настоящее время относительно ограничена. Ранее мы описали гидрогели, полученные из децеллюляризированных легких свиней, и охарактеризовали как их механические, так и материальные свойства, а также продемонстрировали их полезность в качестве моделей клеточных культур18,19. В недавнем отчете подробно описаны первоначальные механические и вязкоупругие характеристики гидрогелей, полученных из децеллюляризованных нормальных и больных (ХОБЛ, ИЛФ) легких человека20. Представлены исходные данные, характеризующие содержание гликозаминогликанов в децеллюляризированных нормальных легких и легких человека с ХОБЛ, а также их применимость для изучения межклеточных и клеточно-ECM-взаимодействий11.
Эти примеры иллюстрируют возможности использования децеллюляризованных РЭБ легких человека в исследовательских целях. Однако легкое является сложным органом, и его структура и функция различаются в разных областях легкого, включая состав ECM и другие свойства, такие как жесткость21,22. Таким образом, представляет интерес изучение ECM в отдельных областях легкого, включая трахею и крупные дыхательные пути, средние и мелкие дыхательные пути и альвеолы, а также крупные, средние и мелкие кровеносные сосуды. С этой целью мы разработали надежный и воспроизводимый метод вскрытия децеллюляризированных легких человека и свиньи и последующей изоляции каждой из этих анатомических областей. Это позволило провести детальный дифференциальный анализ регионального содержания белка как в нормальных, так и в больных легких21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Децеллюляризированные ткани человека и других видов часто используются в качестве биоматериалов для изучения состава ECM, а также взаимодействий между клетками и ECM в моделях культур ex vivo, включая 3D-гидрогели12,13. Подобно другим органам, децеллюляризи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят службы вскрытия UVM за закупку легких человека и доктора философии Роберта Пулио за вклад в общие методы вскрытия. Эти исследования были поддержаны R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated – 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
- López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B. Global burden of COPD. Respirology. 21 (1), 14-23 (2016).
- Raherison, C., Girodet, P. -. O. Epidemiology of COPD. European Respiratory Review. 18 (114), 213-221 (2009).
- Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
- Dickinson, K. M., Collaco, J. M. Cystic Fibrosis. Pediatrics in Review. 42 (2), 55-67 (2021).
- DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252 (2021).
- Young, K. A., Dilling, D. F. The future of lung transplantation. Chest. 155 (3), 465-473 (2019).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658 (2019).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
- Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888 (2022).
- Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
- de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
- Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960 (2023).
- Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).
