Dissectie en isolatie van regiospecifiek gedecellulariseerd longweefsel
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de isolatie van regionaal gedecellulariseerd longweefsel. Dit protocol biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van complexiteiten in de extracellulaire matrix en cel-matrix interacties.
Abstract
Longtransplantatie is vaak de enige optie voor patiënten in de latere stadia van ernstige longziekte, maar dit is beperkt zowel vanwege de levering van geschikte donorlongen als zowel acute als chronische afstoting na transplantatie. Het vaststellen van nieuwe bio-engineeringbenaderingen voor de vervanging van zieke longen is noodzakelijk voor het verbeteren van de overleving van patiënten en het voorkomen van complicaties die verband houden met de huidige transplantatiemethoden. Een alternatieve benadering omvat het gebruik van gedecellulariseerde hele longen zonder cellulaire bestanddelen die meestal de oorzaak zijn van acute en chronische afstoting. Omdat de long zo’n complex orgaan is, is het van belang om de extracellulaire matrixcomponenten van specifieke regio’s te onderzoeken, waaronder de vasculatuur, luchtwegen en alveolair weefsel. Het doel van deze aanpak is om eenvoudige en reproduceerbare methoden vast te stellen waarmee onderzoekers regiospecifiek weefsel uit volledig gedecellulariseerde longen kunnen ontleden en isoleren. Het huidige protocol is bedacht voor varkens- en mensenlongen, maar kan ook op andere soorten worden toegepast. Voor dit protocol werden vier regio’s van het weefsel gespecificeerd: luchtweg, vasculatuur, longblaasjes en bulklongweefsel. Deze procedure maakt het mogelijk om weefselmonsters te verkrijgen die de inhoud van het gedecellulariseerde longweefsel nauwkeuriger weergeven in tegenstelling tot traditionele bulkanalysemethoden.
Introduction
Longziekten, waaronder chronische obstructieve longziekte (COPD), idiopathische longfibrose (IPF) en cystische fibrose (CF), blijven momenteel zonder genezing 1,2,3,4. Longtransplantatie is vaak de enige optie voor patiënten in latere stadia, maar dit blijft een beperkte optie, zowel vanwege de levering van geschikte donorlongen als zowel acute als chronische afstoting na transplantatie 3,5,6. Als zodanig is er een kritieke behoefte aan nieuwe behandelingsstrategieën. Een veelbelovende benadering in respiratoire bio-engineering is de toepassing van van weefsel afgeleide steigers bereid uit gedecellulariseerd inheems longweefsel. Omdat acellulaire hele longsteigers veel van de complexiteit van de oorspronkelijke extracellulaire matrix (ECM) samenstelling en bioactiviteit behouden, zijn ze intensief bestudeerd voor whole-organ engineering en als verbeterde modellen voor het bestuderen van longziektemechanismen 7,8,9,10. Tegelijkertijd is er een toenemende interesse in het gebruik van gedecellulariseerde weefsels van verschillende organen, waaronder longen, als hydrogels en andere substraten voor het bestuderen van cel-cel- en cel-ECM-interacties in organoïde en andere weefselkweekmodellen 11,12,13,14,15,16,17 . Deze bieden meer relevante modellen dan commercieel beschikbare substraten, zoals Matrigel, afgeleid van tumorbronnen. De informatie over van de menselijke longen afgeleide hydrogels is momenteel echter relatief beperkt. We hebben eerder hydrogels beschreven die zijn afgeleid van gedecellulariseerde varkenslongen en hebben zowel hun mechanische als materiaaleigenschappen gekarakteriseerd, evenals hun nut aangetoond als celkweekmodellen18,19. Een recent rapport beschrijft de initiële mechanische en visco-elastische karakterisering van hydrogels afgeleid van gedecellulariseerde normale en zieke (COPD, IPF) menselijke longen20. We hebben ook de eerste gegevens gepresenteerd die het glycosaminoglycaangehalte van gedecellulariseerde normale en COPD menselijke longen karakteriseren, evenals hun toepasbaarheid voor het bestuderen van cel-cel- en cel-ECM-interacties11.
Deze voorbeelden illustreren de kracht van het gebruik van gedecellulariseerde menselijke long-ECM’s voor onderzoeksdoeleinden. De long is echter een complex orgaan en zowel de structuur als de functie variëren in verschillende regio’s van de long, inclusief de samenstelling van de ECM en andere eigenschappen zoals stijfheid21,22. Als zodanig is het van belang om de ECM te bestuderen in individuele regio’s van de long, waaronder de luchtpijp en grote luchtwegen, middelgrote en kleine luchtwegen en longblaasjes, evenals grote, middelgrote en kleine bloedvaten. Hiertoe hebben we een betrouwbare en reproduceerbare methode ontwikkeld voor het ontleden van gedecellulariseerde menselijke en varkenslongen en vervolgens het isoleren van elk van die anatomische gebieden. Dit heeft een gedetailleerde differentiële analyse van het regionale eiwitgehalte in zowel normale als zieke longen mogelijk gemaakt21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gedecellulariseerde weefsels van mensen en andere soorten worden vaak gebruikt als biomaterialen voor het bestuderen van de samenstelling van ECM en cel-ECM-interacties in ex vivo cultuurmodellen, waaronder 3D-hydrogels12,13. Net als andere organen zijn gedecellulariseerde longen eerder gebruikt om ECM-samenstellingsverschillen in gezonde versus zieke (d.w.z. emfysemateuze en IPF) longen te bepalen en worden ze in toenemende mate gebruikt als hydrogels v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de UVM-autopsiediensten voor de verkrijging van menselijke longen en Robert Pouliot, PhD, voor bijdragen aan de algemene dissectietechnieken. Deze studies werden ondersteund door R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated – 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
- López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B. Global burden of COPD. Respirology. 21 (1), 14-23 (2016).
- Raherison, C., Girodet, P. -. O. Epidemiology of COPD. European Respiratory Review. 18 (114), 213-221 (2009).
- Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
- Dickinson, K. M., Collaco, J. M. Cystic Fibrosis. Pediatrics in Review. 42 (2), 55-67 (2021).
- DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252 (2021).
- Young, K. A., Dilling, D. F. The future of lung transplantation. Chest. 155 (3), 465-473 (2019).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658 (2019).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
- Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888 (2022).
- Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
- de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
- Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960 (2023).
- Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).
