Dissektion und Isolierung von regionenspezifisch dezellularisiertem Lungengewebe

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung von regional dezellularisiertem Lungengewebe vorgestellt. Dieses Protokoll bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Komplexitäten in der extrazellulären Matrix und Zell-Matrix-Interaktionen.

Abstract

Die Lungentransplantation ist oft die einzige Option für Patienten in den späteren Stadien einer schweren Lungenerkrankung, die jedoch sowohl durch die Versorgung mit geeigneten Spenderlungen als auch durch die akute und chronische Abstoßung nach der Transplantation begrenzt ist. Die Entwicklung neuer biotechnologischer Ansätze für den Ersatz erkrankter Lungen ist unerlässlich, um das Überleben der Patienten zu verbessern und Komplikationen im Zusammenhang mit den derzeitigen Transplantationsmethoden zu vermeiden. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung von dezellularisierten ganzen Lungen, denen zelluläre Bestandteile fehlen, die typischerweise die Ursache für akute und chronische Abstoßungsreaktionen sind. Da die Lunge ein so komplexes Organ ist, ist es von Interesse, die extrazellulären Matrixkomponenten bestimmter Regionen zu untersuchen, darunter das Gefäßsystem, die Atemwege und das Alveolargewebe. Ziel dieses Ansatzes ist es, einfache und reproduzierbare Methoden zu etablieren, mit denen Forscher regionsspezifisches Gewebe aus vollständig dezellularisierten Lungen sezieren und isolieren können. Das aktuelle Protokoll wurde für die Lunge von Schweinen und Menschen entwickelt, kann aber auch auf andere Tierarten angewendet werden. Für dieses Protokoll wurden vier Geweberegionen spezifiziert: Atemwege, Gefäße, Alveolen und Lungengewebe. Dieses Verfahren ermöglicht die Gewinnung von Gewebeproben, die den Inhalt des dezellularisierten Lungengewebes im Gegensatz zu herkömmlichen Bulk-Analysemethoden genauer darstellen.

Introduction

Lungenerkrankungen, einschließlich chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), idiopathischer Lungenfibrose (IPF) und Mukoviszidose (CF), sind derzeit nicht heilbar 1,2,3,4. Die Lungentransplantation ist oft die einzige Option für Patienten in späteren Stadien, jedoch bleibt dies eine begrenzte Option, sowohl aufgrund der Bereitstellung geeigneter Spenderlungen als auch aufgrund der akuten und chronischen Abstoßung nach der Transplantation ^3,5,6. Daher besteht ein dringender Bedarf an neuen Behandlungsstrategien. Ein vielversprechender Ansatz in der respiratorischen Biotechnik ist die Anwendung von Gewebegerüsten, die aus dezellularisiertem nativem Lungengewebe hergestellt werden. Da azelluläre Gerüste der gesamten Lunge einen Großteil der Komplexität der Zusammensetzung der nativen extrazellulären Matrix (EZM) und der Bioaktivität beibehalten, wurden sie intensiv für das Whole-Organ-Engineering und als verbesserte Modelle für die Untersuchung von Lungenkrankheitsmechanismen untersucht 7,8,9,10. Parallel dazu besteht ein zunehmendes Interesse an der Verwendung von dezellularisiertem Gewebe aus verschiedenen Organen, einschließlich der Lunge, als Hydrogele und andere Substrate für die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionen in Organoid- und anderen Gewebekulturmodellen 11,12,13,14,15,16,17 . Diese liefern relevantere Modelle als kommerziell erhältliche Substrate wie Matrigel, die aus Tumorquellen gewonnen werden. Allerdings sind die Informationen über aus der menschlichen Lunge gewonnene Hydrogele derzeit relativ begrenzt. Wir haben bereits Hydrogele beschrieben, die aus dezellularisierten Schweinelungen gewonnen wurden, und sowohl ihre mechanischen als auch materiellen Eigenschaften charakterisiert sowie ihre Nützlichkeit als Zellkulturmodelle nachgewiesen^18,19. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht wurde die anfängliche mechanische und viskoelastische Charakterisierung von Hydrogelen beschrieben, die aus dezellularisierten, normalen und erkrankten (COPD, IPF) menschlichen Lungen gewonnen wurden²⁰. Wir haben auch erste Daten zur Charakterisierung des Glykosaminoglykangehalts von dezellularisierten normalen und COPD-menschlichen Lungen sowie deren Anwendbarkeit für die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-EZM-Interaktionen^{vorgestellt 11}.

Diese Beispiele veranschaulichen die Leistungsfähigkeit der Verwendung von dezellularisierten menschlichen Lungen-ECMs für Untersuchungszwecke. Die Lunge ist jedoch ein komplexes Organ, und sowohl die Struktur als auch die Funktion variieren in verschiedenen Regionen der Lunge, einschließlich der EZM-Zusammensetzung und anderer Eigenschaften wie Steifigkeit^21,22. Daher ist es von Interesse, die EZM in einzelnen Regionen der Lunge zu untersuchen, einschließlich der Luftröhre und der großen Atemwege, der mittleren und kleinen Atemwege und der Lungenbläschen sowie der großen, mittleren und kleinen Blutgefäße. Zu diesem Zweck haben wir eine zuverlässige und reproduzierbare Methode entwickelt, um dezellularisierte Lungen von Menschen und Schweinen zu sezieren und anschließend jede dieser anatomischen Regionen zu isolieren. Dies ermöglichte eine detaillierte Differentialanalyse des regionalen Proteingehalts sowohl in der normalen als auch in der erkrankten Lunge²¹.

Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der IACUC der University of Vermont (UVM) durchgeführt. Alle menschlichen Lungen wurden von UVM Autopsy Services entnommen und die damit verbundenen Studien wurden gemäß den Richtlinien des IRB von UVM durchgeführt. HINWEIS: Die Dezellularisierung der Lunge von Schweinen und Menschen wurde bereits von unserer Gruppe 7,8,9,10,21 beschrieben.</su…

Representative Results

Ein allgemeines Schema des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Einmal gemeistert, ist die regionale Dissektion von dezellularisiertem Lungengewebe leicht reproduzierbar. Die Bestimmung der Kategorisierung jeder abgetrennten Gewebeprobe ist für den Erfolg des Dissektionsverfahrens unerlässlich. Gefäßgewebe ist wesentlich elastischer als die Atemwege, daher ist die Verwendung einer Pinzette zur Dehnung des Gewebes oft ein starker Indikator dafür, ob es sich bei einer bestimmten Pro…

Discussion

Dezellularisiertes Gewebe von Menschen und anderen Spezies wird häufig als Biomaterial für die Untersuchung der EZM-Zusammensetzung sowie der Zell-EZM-Interaktionen in Ex-vivo-Kulturmodellen, einschließlich 3D-Hydrogelen, verwendet^12,13. Ähnlich wie andere Organe wurden dezellularisierte Lungen in der Vergangenheit verwendet, um Unterschiede in der EZM-Zusammensetzung in gesunden und kranken (d. h. emphysematösen und IPF) Lungen zu bestimmen, und we…

Materials

Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 – Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated – 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10