דיסקציה ובידוד של רקמת ריאה דה-צלולרית ספציפית לאזור
Summary
מוצג כאן פרוטוקול לבידוד רקמת ריאה אזורית דה-צלולרית. פרוטוקול זה מספק כלי רב עוצמה לחקר מורכבויות באינטראקציות מטריצה חוץ-תאית ומטריצת תאים.
Abstract
השתלת ריאות היא לרוב האפשרות היחידה לחולים בשלבים מאוחרים יותר של מחלת ריאות קשה, אך זו מוגבלת הן בשל אספקת ריאות מתאימות מתורם והן בדחייה חריפה וכרונית לאחר ההשתלה. בירור גישות ביו-הנדסיות חדשניות להחלפת ריאות חולות הוא הכרחי לשיפור הישרדות המטופלים ולמניעת סיבוכים הקשורים למתודולוגיות ההשתלה הנוכחיות. גישה חלופית כוללת שימוש בריאות שלמות דה-תאיות חסרות מרכיבים תאיים שהם בדרך כלל הגורם לדחייה חריפה וכרונית. מכיוון שהריאה היא איבר כה מורכב, מעניין לבחון את מרכיבי המטריקס החוץ תאיים של אזורים ספציפיים, כולל כלי הדם, דרכי הנשימה והרקמה הנאדית. מטרת גישה זו היא לבסס שיטות פשוטות וניתנות לשחזור שבאמצעותן חוקרים יכולים לנתח ולבודד רקמות ספציפיות לאזור מריאות שאינן סלולריות במלואן. הפרוטוקול הנוכחי פותח עבור חזירים וריאות אנושיות, אך עשוי להיות מיושם גם על מינים אחרים. עבור פרוטוקול זה צוינו ארבעה אזורים ברקמה: דרכי הנשימה, כלי הדם, הנאדיות ורקמת הריאה בתפזורת. הליך זה מאפשר רכישת דגימות של רקמה המייצגות בצורה מדויקת יותר את תוכן רקמת הריאה הדה-צלולרית בניגוד לשיטות ניתוח מסורתיות בתפזורת.
Introduction
מחלות ריאה, כולל מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF) וסיסטיק פיברוזיס (CF), נותרות כיום ללא תרופה 1,2,3,4. השתלת ריאות היא לעתים קרובות האפשרות היחידה עבור חולים בשלבים מאוחרים יותר, אולם זו נותרה אפשרות מוגבלת הן בשל אספקת ריאות תורם מתאימות והן דחייה חריפה וכרונית לאחר ההשתלה 3,5,6. ככזה, יש צורך קריטי באסטרטגיות טיפול חדשות. גישה מבטיחה אחת בביו-הנדסה נשימתית היא יישום של פיגומים שמקורם ברקמות, שהוכנו מרקמת ריאה טבעית שעברה דה-צלולריזציה. מכיוון שפיגומי ריאה שלמים אצלולריים שומרים על חלק ניכר מהמורכבות של הרכב המטריצה החוץ-תאית הטבעית (ECM) והפעילות הביולוגית, הם נחקרו באופן אינטנסיבי עבור הנדסת איברים שלמים וכמודלים משופרים לחקר מנגנוני מחלות ריאה 7,8,9,10. במקביל, יש עניין גובר בשימוש ברקמות דה-תאיות מאיברים שונים, כולל ריאות, כהידרוג’לים ומצעים אחרים לחקר אינטראקציות תא-תא ו-ECM של תאים במודלים של תרביות אורגנואידים ורקמות אחרות 11,12,13,14,15,16,17. אלה מספקים מודלים רלוונטיים יותר מאשר מצעים זמינים מסחרית, כגון Matrigel, שמקורם במקורות סרטניים. עם זאת, המידע על הידרוג’לים שמקורם בריאה אנושית מוגבל יחסית כיום. תיארנו בעבר הידרוג’לים שמקורם בריאות חזיר decellularized ואפיינו הן את התכונות המכניות והן את התכונות החומריות שלהם, כמו גם הדגמנו את התועלת שלהם כמודלים של תרביות תאים18,19. דו”ח שפורסם לאחרונה פירט את האפיון המכאני והויסקו-אלסטי הראשוני של הידרוג’לים שמקורם בריאות אנושיות נורמליות וחולות (COPD, IPF)20. כמו כן, הצגנו נתונים ראשוניים המאפיינים את תכולת הגליקוזאמינוגליקן של ריאות אנושיות תקינות ו- COPD דה-צלולריות, כמו גם את יישומם לחקר אינטראקציות תא-תא ו-ECMשל תאים 11.
דוגמאות אלה ממחישות את הכוח של שימוש באק”מ ריאה אנושית דה-צלולרית למטרות חקירה. עם זאת, הריאה היא איבר מורכב, והן המבנה והתפקוד משתנים באזורים שונים של הריאה, כולל הרכב ECM ותכונות אחרות כגון נוקשות21,22. ככזה, זה מעניין לחקור את ECM באזורים בודדים של הריאה, כולל קנה הנשימה ודרכי נשימה גדולות, דרכי נשימה בינוניות וקטנות, נאדיות, כמו גם כלי דם גדולים, בינוניים, קטנים. לשם כך, פיתחנו שיטה אמינה וניתנת לשחזור לניתוח ריאות אנושיות וחזירות שעברו דה-צלולריזציה, ולאחר מכן בידוד כל אחד מהאזורים האנטומיים הללו. זה איפשר ניתוח דיפרנציאלי מפורט של תכולת חלבון אזורית הן בריאות נורמליות והן בריאות חולות21.
Protocol
Representative Results
Discussion
רקמות דה-תאיות מבני אדם וממינים אחרים משמשות לעתים קרובות כביו-חומרים לחקר הרכב ECM וכן אינטראקציות תא-ECM במודלים של תרביות ex vivo, כולל הידרוג’לים תלת-ממדיים12,13. בדומה לאיברים אחרים, ריאות דה-תאיות שימשו בעבר לקביעת הבדלים בהרכב ECM בריאות לעומת חולות (כלומר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לשירותי נתיחת UVM לאחר המוות על רכישת ריאות אנושיות ולדוקטורט רוברט פוליוט על תרומתם לטכניקות הדיסקציה הכוללות. מחקרים אלה נתמכו על ידי R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated – 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
- López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B. Global burden of COPD. Respirology. 21 (1), 14-23 (2016).
- Raherison, C., Girodet, P. -. O. Epidemiology of COPD. European Respiratory Review. 18 (114), 213-221 (2009).
- Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
- Dickinson, K. M., Collaco, J. M. Cystic Fibrosis. Pediatrics in Review. 42 (2), 55-67 (2021).
- DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252 (2021).
- Young, K. A., Dilling, D. F. The future of lung transplantation. Chest. 155 (3), 465-473 (2019).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658 (2019).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
- Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888 (2022).
- Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
- de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
- Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960 (2023).
- Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).
