Modélisation de tumeurs cérébrales in vivo à l’aide de l’administration par électroporation d’ADN plasmidique représentant les signatures de mutation des patients
Summary
L’utilisation d’un modèle de tumeur autochtone immunocompétent piloté par des mutations courantes de patients pour les tests précliniques est essentielle pour les tests immunothérapeutiques. Ce protocole décrit une méthode pour générer des modèles murins de tumeurs cérébrales en utilisant l’administration d’ADN plasmidique basée sur l’électroporation qui représentent les mutations courantes des patients, fournissant ainsi un modèle murin précis, reproductible et cohérent.
Abstract
Les modèles tumoraux sont essentiels pour les tests précliniques des tumeurs cérébrales en termes d’exploration de nouveaux traitements plus efficaces. Avec un intérêt significatif pour l’immunothérapie, il est encore plus essentiel de disposer d’un modèle murin immunocompétent cohérent et cliniquement pertinent pour examiner les populations de cellules tumorales et immunitaires dans le cerveau et leur réponse au traitement. Alors que la plupart des modèles précliniques utilisent la transplantation orthotopique de lignées cellulaires tumorales établies, le système de modélisation présenté ici permet une représentation « personnalisée » des mutations tumorales spécifiques au patient dans un développement progressif mais efficace à partir de constructions d’ADN insérées dans des cellules précurseurs neurales (NPC) en division in vivo. Les constructions d’ADN comportent l’analyse en mosaïque avec la méthode d’échange de cassettes médiée par la double recombinase (MADR), ce qui permet une mutagenèse somatique en une seule copie des mutations du moteur. En utilisant des souriceaux nouveau-nés entre la naissance et l’âge de 3 jours, les PNJ sont ciblés en tirant parti de ces cellules en division qui tapissent les ventricules latéraux. La micro-injection de plasmides d’ADN (p. ex., dérivés de MADR, transposons, ARNsg dirigé par CRISPR) dans les ventricules est suivie d’une électroporation à l’aide de palettes qui entourent la région rostrale de la tête. Lors de la stimulation électrique, l’ADN est absorbé dans les cellules en division, avec le potentiel de s’intégrer dans le génome. L’utilisation de cette méthode a été démontrée avec succès dans le développement de tumeurs cérébrales pédiatriques et adultes, y compris la tumeur cérébrale maligne la plus courante, le glioblastome. Cet article discute et démontre les différentes étapes du développement d’un modèle de tumeur cérébrale à l’aide de cette technique, y compris la procédure d’anesthésie des jeunes souriceaux, à la micro-injection du mélange plasmidique, suivie de l’électroporation. Grâce à ce modèle murin autochtone et immunocompétent, les chercheurs auront la possibilité d’élargir les approches de modélisation préclinique, dans le but d’améliorer et d’examiner un traitement efficace du cancer.
Introduction
Les modèles murins de tumeurs cérébrales sont cruciaux pour comprendre les mécanismes de formation et de traitement des tumeurs cérébrales. Les modèles actuels comprennent généralement des transplantations sous-cutanées ou orthotopiques rapidement produites de lignées cellulaires tumorales couramment utilisées, basées sur un nombre limité de mutations pilotes ou de modèles de xénogreffes dérivés de patients, en utilisant des souris immunodéficientes qui entravent les études d’immunothérapie appropriées 1,2,3,4. De plus, ces résultats précliniques peuvent conduire à des faux positifs, en ce sens que de tels modèles peuvent présenter des effets spectaculaires, souvent curatifs, en réponse au traitement, mais cela ne se traduit pas en clinique 2,5,6,7. Il est impératif d’avoir la capacité de produire rapidement des modèles de souris précliniques génétiquement modifiés qui reflètent mieux les signatures de mutation des patients pour améliorer la validité des résultats précliniques.
L’administration de plasmides d’ADN basée sur l’électroporation (EP) pour induire à la fois des mutations de perte de fonction (LOF) et de gain de fonction (GOF) permet de générer de tels modèles. Nous avons mis au point une méthode pour une représentation encore plus précise des mutations du pilote GOF appelée analyse en mosaïque avec échange de cassettes médié par la double recombinase, ou MADR8. Cette méthode permet l’expression d’un gène (ou de gènes) d’intérêt de manière contrôlée et spécifique au locus dans les cellules somatiques8. En combinaison avec d’autres outils moléculaires, tels que les courtes répétitions palindromiques groupées régulièrement espacées (CRISPR), différentes mutations de patients peuvent être combinées pour développer des modèles de tumeurs cérébrales chez la souris. Cette méthode a été utilisée pour différentes tumeurs cérébrales pédiatriques, y compris les gliomes et les épendymomes8, ainsi que pour des modèles de tumeurs cérébrales adultes, telles que le glioblastome (GBM).
Bien que la méthode EP de modélisation tumorale ne soit pas aussi courante qu’une greffe, ce qui suit démontre jusqu’à présent la facilité et la grande reproductibilité de ce système de modélisation. Les souris mTmG sont utilisées pour l’insertion de l’ADN plasmidique MADR 8,9. Ce système permet la recombinaison des sites cibles de la recombinase (FRT) loxP et Flp situés au locus Rosa26 pour l’insertion ultérieure du plasmide d’ADN du donneur (c’est-à-dire le gène GOF d’intérêt)8,9. Le protocole suivant démontre la simplicité de cette méthode après une pratique assidue, et la capacité de développer des modèles de tumeurs cérébrales de souris d’une manière autochtone et cohérente.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’administration d’ADN plasmidique basée sur l’électroporation permet l’utilisation in vivo de la biologie moléculaire, similaire à celle utilisée dans les modèles murins génétiquement modifiés, mais avec la vitesse, la localisation et l’efficacité de la transduction virale 8,13,14. Ce dernier s’accompagne toutefois de problèmes de sécurité ainsi que de réponses immunitaires. Nous avons montré…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Gi Bum Kim pour la coloration et les images par immunofluorescence. Nous remercions également Emily Hatanaka, Naomi Kobritz et Paul Linesch pour leurs conseils utiles sur le protocole.
Materials
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled – see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
