Presentert her er en effektiv rask blodperfusjonsprotokoll for å forberede vevsprøver fra afrikanske klørfrosker for transkriptomikk og proteomikkstudier.
Xenopus har vært kraftige modellorganismer for å forstå virveldyrutvikling og sykdom i over 100 år. Her defineres en rask blodperfusjonsprotokoll i Xenopus, rettet mot en konsistent og drastisk reduksjon av blod i alle vev. Perfusjon utføres ved å sette en nål direkte inn i hjertets ventrikkel og pumpe heparinisert fosfatbufret saltvann (PBS) gjennom det vaskulære systemet. Prosedyren kan fullføres på ca. 10 minutter per dyr. Blodet domineres av noen få svært rikelig proteiner og celletyper, noe som skaper mange problemer da disse proteinene maskerer de fleste andre molekyler og celletyper av interesse. Den reproduserbare karakteriseringen av voksne Xenopus-vev med kvantitativ proteomikk og enkeltcelletranskriptomikk vil ha nytte av å anvende denne protokollen før organprøvetaking. Protokollene for vevsprøvetaking er definert i ledsagerpapir. Disse prosedyrene er rettet mot standardisering av praksis på tvers av Xenopus av forskjellig kjønn, alder og helsestatus, spesielt X. laevis og X. tropicalis.
Hele kroppens perfusjon av amfibier er rutinemessig fullført med henblikk på bevaring og fiksering 1,2,3,4,5,6. Imidlertid skjer disse prosedyrene med en hastighet som begrenser antall ferske prøver som kan tas per dyr. Målet med dette arbeidet er å utvikle en effektiv blodperfusjonsprotokoll i Xenopus, og prioritere teknikkens hastighet. Protokollen tar mindre enn 10 min per dyr for X. tropicalis og mindre enn 15 min per X. laevis dyr. De sekundære prioriteringene er enkel replikering og bruk av lett anskaffet utstyr, slik at prøver av høy kvalitet kan deles mye mellom Xenopus-laboratorier.
Xenopus frosker brukes mye i biomedisinsk forskning for å studere grunnleggende biologiske og patologiske prosesser bevart på tvers av arter. Denne tetrapoden har et nærmere evolusjonært forhold til pattedyr enn andre akvatiske modeller, og har lunger, et trekammerhjerte og lemmer med sifre. Det internasjonale samfunnet bruker effektivt Xenopus for å få en dypere forståelse av menneskelig sykdom gjennom grundig sykdomsmodellering og molekylær analyse av sykdomsrelatert genfunksjon. De mange fordelene med Xenopus som dyremodell gjør dem uvurderlige verktøy for å studere det molekylære grunnlaget for menneskelig utvikling og sykdom; Disse fordelene inkluderer: stor oocytt- og embryostørrelse, høy fruktbarhet, enkel bolig, rask ekstern utvikling og enkel genomisk manipulasjon. Xenopus har blitt anslått å dele ~ 80% av de identifiserte menneskelige sykdomsgenene7.
Sammenlignet med populære pattedyrmodeller er Xenopus en rask, kostnadseffektiv modell, med enkel morfolino-nedslag og tilgjengeligheten av effektive transgene og målrettede genmutasjoner ved bruk av CRISPR8. Kvantitativ massespektrometri og encellet transkriptomikk har blitt brukt med hell på Xenopus-embryoer9,10, men et nylig celleatlas fra Xenopus laevis viser at sammensetningen av de fleste vev domineres av blodcelletyper11. Ved å utvikle en teknikk som ekssanguinerer vev i rask hastighet og ved bruk av kjølte medier, påvirkes prøvens friskhet minimalt av perfusjon. Dette er spesielt viktig for applikasjoner der målet er å profilere fysiologisk uforstyrret mRNA eller proteinuttrykk.
Denne protokollen beskriver tradisjonelle disseksjonsteknikker for tilgang til coelomic cavity. Andre teknikker er også akseptable, forutsatt at de forårsaker minimal skade på vevet, hjertet er tilgjengelig, og lungen og magen er synlige. På samme måte kan de fleste disseksjonsverktøy som er oppført, enkelt erstattes med sammenlignbare elementer.
Mens forsøk har blitt gjort for å optimalisere effekten av denne prosedyren, kan resultatene variere avhengig av ens erfaring og variabilite…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIHs OD R24 grant OD031956 og NICHD R01 grant HD073104. Vi takker Darcy Kelly for nyttige diskusjoner og innledende innspill til denne protokollen. Vi vil også takke Samantha Jalbert, Jill Ralston og Wil Ratzan for deres hjelp og støtte, samt våre tre anonyme fagfeller for deres tilbakemeldinger.
5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |