アフリカツメガエルにおける効果的な急速な血液灌流
Summary
ここでは、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクス研究のためにアフリカツメガエルから組織サンプルを調製するための効果的な迅速な血液灌流プロトコルを示します。
Abstract
アフリカツメガエル は、100年以上にわたり脊椎動物の発育と疾患を理解するための強力なモデル生物でした。ここでは、すべての組織内の血液の一貫した劇的な減少を目的とした 、アフリカツメガエル の急速な血液灌流プロトコルが定義されています。灌流は、心臓の心室に直接針を挿入し、血管系を通してヘパリン化リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をポンピングすることによって行われます。この手順は、動物あたり約10分で完了することができます。血液はいくつかの非常に豊富なタンパク質と細胞タイプによって支配されており、これらのタンパク質が他のほとんどの分子と関心のある細胞タイプを隠すため、多くの問題を引き起こします。定量的プロテオミクスおよび単一細胞トランスクリプトミクスによる成人アフリカ ツメガエル 組織の再現性のある特性評価は、臓器サンプリングの前にこのプロトコルを適用することで恩恵を受けます。組織サンプリングのプロトコルは、コンパニオンペーパーで定義されています。これらの手順は、性別、年齢、健康状態の異なる アフリカツメガエル 、特に X. laevis と X. tropicalisにわたる慣行の標準化を目的としています。
Introduction
両生類の全身灌流は、保存および固定の目的で日常的に完了する1,2,3,4,5,6。ただし、これらの手順は、動物ごとに採取できる新鮮なサンプルの数を制限する速度で行われます。この研究の目標は、アフリカツメガエルの効果的な血液灌流プロトコルを開発し、技術の速度を優先することです。このプロトコルは、X. tropicalisでは動物あたり10分未満、X. laevis動物では15分未満かかります。二次的な優先事項は、複製の容易さと、高品質のサンプルをアフリカツメガエルのラボ間で広く共有できるように、簡単に入手できる機器の使用です。
アフリカツメガエル は、種を超えて保存されている基本的な生物学的および病理学的プロセスを研究するために、生物医学研究で広く使用されています。この四肢動物は、他の水生モデルよりも哺乳類とより密接な進化的関係を持ち、肺、3室の心臓、指のある手足を持っています。国際社会は、 アフリカツメガエル を効果的に利用して、詳細な疾患モデリングと疾患関連遺伝子機能の分子解析を通じて、ヒトの疾患をより深く理解しています。動物モデルとしての アフリカツメガエル の多くの利点は、それらを人間の発達と病気の分子基盤を研究するための非常に貴重なツールにします。これらの利点には、卵母細胞と胚のサイズが大きい、繁殖力が高い、飼育の容易さ、迅速な外部発生、およびゲノム操作の容易さが含まれます。 アフリカツメガエル は、同定されたヒト疾患遺伝子の~80%を共有すると推定されています7。
一般的な哺乳類モデルと比較して、アフリカツメガエルは迅速で費用効果の高いモデルであり、モルホリノノックダウンが容易で、CRISPR8を使用した効率的なトランスジェニックおよび標的遺伝子変異を利用できます。定量的質量分析と単一細胞トランスクリプトミクスはアフリカツメガエルの胚にうまく適用されています9,10が、アフリカツメガエルの最近の細胞アトラスは、ほとんどの組織の組成が血球型によって支配されていることを示しています11。組織を急速に放血する技術を開発し、冷却培地を使用することにより、サンプルの鮮度は灌流による影響を最小限に抑えます。これは、生理学的に摂動されていないmRNAまたはタンパク質発現のプロファイリングを目的とするアプリケーションにとって特に重要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、体腔にアクセスするための伝統的な解剖技術について説明しています。組織への損傷が最小限で、心臓にアクセスでき、肺と胃が見える限り、他の技術も受け入れられます。同様に、リストされているほとんどの解剖ツールは、同等のアイテムで簡単に置き換えることができます。
この手順の有効性を最適化する試みがなされてきましたが、結果は?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIHのOD R24グラントOD031956とNICHD R01グラントHD073104によってサポートされました。このプロトコルに関する有益な議論と最初のインプットを提供してくれたDarcy Kellyに感謝します。また、Samantha Jalbert、Jill Ralston、Wil Ratzanの支援とサポート、およびフィードバックを提供してくれた3人の匿名の査読者にも感謝します。
Materials
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
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