जेनोपस में प्रभावी तेजी से रक्त छिड़काव

Summary

यहां प्रस्तुत ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स और प्रोटिओमिक्स अध्ययन के लिए अफ्रीकी पंजे वाले मेंढकों से ऊतक के नमूने तैयार करने के लिए एक प्रभावी तेजी से रक्त छिड़काव प्रोटोकॉल है।

Abstract

जेनोपस 100 से अधिक वर्षों से कशेरुक विकास और बीमारी को समझने के लिए शक्तिशाली मॉडल जीव रहे हैं। यहां, जेनोपस में एक तेजी से रक्त छिड़काव प्रोटोकॉल, जिसका उद्देश्य सभी ऊतकों के भीतर रक्त की लगातार और कठोर कमी है, को परिभाषित किया गया है। छिड़काव सीधे हृदय के वेंट्रिकल में एक सुई डालकर और संवहनी प्रणाली के माध्यम से हेपरिनाइज्ड फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) पंप करके किया जाता है। प्रक्रिया प्रति जानवर लगभग 10 मिनट में पूरी की जा सकती है। रक्त में कुछ अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन और सेल प्रकारों का वर्चस्व होता है, जिससे कई समस्याएं पैदा होती हैं क्योंकि ये प्रोटीन अधिकांश अन्य अणुओं और सेल प्रकार की रुचि को मुखौटा करते हैं। मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स और एकल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स के साथ वयस्क जेनोपस ऊतकों के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लक्षण वर्णन अंग नमूनाकरण से पहले इस प्रोटोकॉल को लागू करने से लाभान्वित होगा। ऊतक नमूनाकरण के लिए प्रोटोकॉल साथी कागजात में परिभाषित किए गए हैं। इन प्रक्रियाओं का उद्देश्य विभिन्न लिंग, आयु और स्वास्थ्य की स्थिति के जेनोपस में प्रथाओं के मानकीकरण के उद्देश्य से है, विशेष रूप से एक्स लेविस और एक्स ट्रॉपिकलिस।

Introduction

उभयचरों के पूरे शरीर का छिड़काव नियमित रूप से संरक्षण और निर्धारण 1,2,3,4,5,6 के प्रयोजनों के लिए पूरा किया जाता है। हालांकि, ये प्रक्रियाएं एक ऐसी दर पर होती हैं जो प्रति जानवर लिए जा सकने वाले ताजा नमूनों की संख्या को सीमित करती हैं। इस काम का लक्ष्य तकनीक की गति को प्राथमिकता देते हुए जेनोपस में एक प्रभावी रक्त छिड़काव प्रोटोकॉल विकसित करना है। प्रोटोकॉल एक्स उष्णकटिबंधीय के लिए प्रति जानवर 10 मिनट से कम और एक्स लेविस जानवर के लिए 15 मिनट से कम समय लेता है। द्वितीयक प्राथमिकताएं प्रतिकृति में आसानी और आसानी से अधिग्रहित उपकरणों का उपयोग हैं ताकि उच्च गुणवत्ता वाले नमूने जेनोपस प्रयोगशालाओं के बीच व्यापक रूप से साझा किए जा सकें।

प्रजातियों में संरक्षित मौलिक जैविक और रोग प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए बायोमेडिकल अनुसंधान में जेनोपस मेंढकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इस टेट्रापॉड का अन्य जलीय मॉडल की तुलना में स्तनधारियों के साथ घनिष्ठ विकासवादी संबंध है, जिसमें फेफड़े, तीन-कक्षीय हृदय और अंकों वाले अंग होते हैं। अंतर्राष्ट्रीय समुदाय प्रभावी रूप से गहराई से रोग मॉडलिंग और रोग से संबंधित जीन फ़ंक्शन के आणविक विश्लेषण के माध्यम से मानव रोग की गहरी समझ हासिल करने के लिए जेनोपस का उपयोग करता है। एक पशु मॉडल के रूप में जेनोपस के कई फायदे उन्हें मानव विकास और बीमारी के आणविक आधार का अध्ययन करने के लिए अमूल्य उपकरण बनाते हैं; इन फायदों में शामिल हैं: बड़े अंडाणु और भ्रूण का आकार, उच्च उर्वरता, आवास में आसानी, तेजी से बाहरी विकास और जीनोमिक हेरफेर में आसानी। जेनोपस को पहचाने गए मानव रोग जीन⁷ का ~ 80% साझा करने का अनुमान लगाया गया है।

लोकप्रिय स्तनधारी मॉडल की तुलना में, जेनोपस एक तेज, लागत प्रभावी मॉडल है, जिसमें मोर्फोलिनो नॉक-डाउन की आसानी और सीआरआईएसपीआर⁸ का उपयोग करके कुशल ट्रांसजेनिक और लक्षित जीन उत्परिवर्तन की उपलब्धता है। मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री और सिंगल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स को जेनोपस भ्रूण 9,10 पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है^, लेकिन जेनोपस लेविस से एक हालिया सेल एटलस से पता चलता है कि अधिकांश ऊतकों की संरचना रक्त कोशिका प्रकार ¹¹ पर हावी है। एक ऐसी तकनीक विकसित करके जो तीव्र दर से ऊतक को बाहर निकालता है और ठंडा मीडिया का उपयोग करके, छिड़काव से नमूना ताजगी कम से कम प्रभावित होती है। यह उन अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां लक्ष्य शारीरिक रूप से अप्रभावित एमआरएनए या प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रोफाइल करना है।

Protocol

सभी प्रयोग हार्वर्ड मेडिकल स्कूल IACUC (संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति) (IS 00001365_3) के नियमों और विनियमों के अनुसार किए गए थे। नोट: यद्यपि वर्णित इच्छामृत्यु की प्राथमिक विधि को अमेरिकन वेटरनरी ?…

Representative Results

सफल छिड़काव के बाद, सभी ऊतक (पिगमेंटेड जेनोपस में यकृत को छोड़कर) रक्त से स्पष्ट रूप से हल्के और कम संतृप्त होंगे। प्रमुख रक्त वाहिकाएं कम ध्यान देने योग्य हो जाएंगी (चित्रा 10), और ऊतक (यकृत ?…

Discussion

यह प्रोटोकॉल कोइलोमिक गुहा तक पहुंचने के लिए पारंपरिक विच्छेदन तकनीकों का वर्णन करता है। अन्य तकनीकें भी स्वीकार्य हैं, बशर्ते वे ऊतकों को कम से कम नुकसान पहुंचाएं, हृदय सुलभ हो, और फेफड़े और पेट दिखाई …

Materials

5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP