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Biology

Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65304
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

Summary

Esta técnica describe un flujo de trabajo efectivo para visualizar y medir cuantitativamente el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido dentro de las células HeLa utilizando imágenes en vivo basadas en fluorescencia.

Abstract

Las mitocondrias son orgánulos dinámicos críticos para la homeostasis metabólica mediante el control de la producción de energía a través de la síntesis de ATP. Para apoyar el metabolismo celular, varios mecanismos de control de calidad mitocondrial cooperan para mantener una red mitocondrial saludable. Una de estas vías es la mitofagia, donde la quinasa 1 inducida por PTEN (PINK1) y la fosfoubiquitinación Parkin de las mitocondrias dañadas facilitan el secuestro de autofagosomas y la posterior eliminación de la célula a través de la fusión de lisosomas. La mitofagia es importante para la homeostasis celular, y las mutaciones en Parkin están relacionadas con la enfermedad de Parkinson (EP). Debido a estos hallazgos, ha habido un énfasis significativo en la investigación del daño mitocondrial y el recambio para comprender los mecanismos moleculares y la dinámica del control de calidad mitocondrial. Aquí, se utilizaron imágenes de células vivas para visualizar la red mitocondrial de células HeLa, para cuantificar el potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido después del tratamiento con cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona (CCCP), un agente de desacoplamiento mitocondrial. Además, se expresó una mutación ligada a la PD de Parkin (ParkinT240R) que inhibe la mitofagia dependiente de Parkin para determinar cómo la expresión mutante afecta la red mitocondrial en comparación con las células que expresan Parkin de tipo salvaje. El protocolo descrito aquí describe un flujo de trabajo simple que utiliza enfoques basados en fluorescencia para cuantificar el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido de manera efectiva.

Introduction

La red mitocondrial es una serie de orgánulos interconectados que desempeñan un papel crucial en la producción de energía1, la inmunidad innata 2,3 y la señalización celular 4,5. La desregulación mitocondrial se ha asociado con enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson (EP)6,7. La EP es un trastorno neurodegenerativo progresivo que afecta a las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra y que afecta a casi 10 millones de personas en todo el mundo8. La EP se ha relacionado genéticamente con la mitofagia, una vía de control de calidad mitocondrial necesaria para mantener la homeostasis celular que elimina selectivamente las mitocondrias dañadas 9,10. Los estudios han identificado múltiples vías de mitofagia independientes, incluida la mitofagia mediada por el dominio FUN14 que contiene 1 (FUNDC1), la mitofagia facilitada por la proteína 3 que interactúa con Bcl-2 (BNIP3), la mitofagia dependiente de NIX y la bien caracterizada quinasa 1 inducida por PTEN (PINK1) / mitofagia regulada por Parkin10,11. PINK1 (una quinasa putativa) y Parkin (una ubiquitina ligasa E3) trabajan en conjunto para fosfo-ubiquitinar las mitocondrias dañadas, lo que impulsa la formación de autofagosomas que engullen el orgánulo dañado y se fusionan con los lisosomas para iniciar la degradación 12,13,14,15,16. Las mutaciones en Parkin se han asociado con fenotipos ligados a la EP, como la neurodegeneración a través de la pérdida de neuronas dopaminérgicas17,18.

Aquí, se describe un protocolo en el que las células HeLa, células inmortalizadas utilizadas rutinariamente derivadas del cáncer cervical, se utilizan para investigar el papel de Parkin en el mantenimiento de la salud de la red mitocondrial. Las células HeLa expresan niveles insignificantes de Parkin endógeno y, por lo tanto, requieren expresión exógena de Parkin19. Para estudiar el papel de Parkin en la salud de la red mitocondrial, las células HeLa se transectan con Parkin de tipo salvaje (ParkinWT), un mutante Parkin (ParkinT240R) o un vector de control vacío. ParkinT240R es una mutación de parkinsonismo juvenil autosómico recesivo que afecta a la actividad de la ligasa Parkin E3, reduciendo significativamente la eficiencia de la vía de mitofagia20. Las células HeLa están sujetas a concentraciones leves (5 μM) o graves (20 μM) de cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona (CCCP), un agente de desacoplamiento mitocondrial. El tratamiento con concentraciones severas de CCCP se utiliza rutinariamente para inducir mitofagia mediada por Parkin en varias líneas celulares, como las células HeLa y COS-721,22,23.

Después del tratamiento, el protocolo emplea imágenes en vivo de la red mitocondrial utilizando dos tintes fluorescentes dirigidos a mitocondriales actualmente disponibles. La tetrametilrodamina, éster etílico, perclorato (TMRE) es un colorante catiónico que emite fluorescencia en función del potencial de membrana mitocondrial24, mientras que MitoSOX es un indicador de superóxido mitocondrial donde la intensidad de fluorescencia es una función de la concentración de superóxido25. Finalmente, el protocolo descrito utiliza una cuantificación basada en fluorescencia y un flujo de trabajo simple para cuantificar de manera efectiva el potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido con un alcance mínimo para el sesgo del usuario. Aunque este protocolo fue diseñado para estudiar la función mitocondrial en células HeLa, se puede adaptar para líneas celulares adicionales y tipos de células primarias para caracterizar cuantitativamente la salud de la red mitocondrial.

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Protocol

1. Preparación de muestras biológicas

NOTA: Realice los siguientes pasos utilizando una técnica estéril en un gabinete de bioseguridad. Rocíe la superficie del gabinete y todos los materiales con etanol al 70%.

  1. Cultivo y transfección de células HeLa
    1. Cultive 30.000 células HeLa en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 4,5 g/L de glucosa suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de solución de L-glutamina (HeLa media; ver Tabla de materiales). Coloque las células en platos de imágenes con fondo de vidrio de 35 mm (ver Table of Materials) que contengan 2 ml de medios HeLa precalentados. Mantener los cultivos HeLa al 5% deCO2 y 37 °C26,27.
    2. El día después del emplatado, inspeccione los platos de imágenes de 35 mm con un microscopio óptico para asegurarse de que las células sean ~ 50% -60% confluentes. Una vez confluentes, transfecten las células HeLa con el vector vacío de proteína fluorescente amarilla (YFP), YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R (Figura 1A).
    3. Prepare dos mezclas separadas en tubos de microcentrífuga estériles para cada transfección. Mezclar golpeando el tubo o pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
      1. En el tubo 1, mezclar 200 μL de medios séricos reducidos (ver Tabla de materiales) con 2 μg de ADN plásmido.
      2. En el tubo 2, mezclar 200 μL de medio sérico reducido con 6 μL de reactivo de transfección (ver Tabla de materiales)28.
    4. Incubar los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Agregue el tubo 2 al tubo 1, mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo, e incube durante 20 minutos en RT.
    5. Agregue los complejos de transfección gota a gota a las placas de imágenes existentes que contienen los cultivos de células HeLa, asegurando una distribución equitativa en toda la placa. Coloque las placas de imagen en la incubadora deCO2 al 5% y 37 °C durante la noche.
      NOTA: Etiquete cada plato con el plásmido transfectado apropiado. Para cada experimento, etiquete las tres placas YFP-ParkinWT (dimetilsulfóxido [DMSO; consulte la Tabla de materiales], CCCP de 5 μM y CCCP de 20 μM). Repita el etiquetado con los tres platos YFP-ParkinT240R y los tres platos vectoriales YFP vacíos.
  2. Preparación de CCCP y colorantes fluorescentes
    PRECAUCIÓN: Los tintes fluorescentes son a menudo sensibles a la luz. Guarde los tintes en la oscuridad usando papel de aluminio o tubos centrífugos marrones para reducir la exposición a la luz.
    1. Haga un material de trabajo de 5 mM de CCCP (ver Tabla de materiales) disolviendo 5 mg de CCCP en 4.89 ml de DMSO. Haga un material de trabajo de 20 mM de CCCP disolviendo 5 mg de CCCP en 1.22 ml de DMSO.
    2. Diluir 10 μL de una solución madre de 1 mM MitoTracker Deep Red (ver Tabla de materiales) en 390 μL de DMSO para hacer un material de trabajo de 25 μM.
    3. Disuelva 50 μg de MitoSOX Red25 (consulte la Tabla de materiales) en 13 μL de DMSO para crear un material de trabajo de 5 mM.
    4. Disuelva 10 mg de TMRE24 (ver Tabla de materiales) en 19,4 ml de DMSO para hacer una solución madre de 1 mM. Diluir el TMRE añadiendo 10 μL de 1 mM TMRE en 990 μL de DMSO para formar un material de trabajo de 10 μM.

2. Tratamiento CCCP y marcaje mitocondrial con sondas fluorescentes en células HeLa

PRECAUCIÓN: Realice los siguientes pasos rápidamente para asegurarse de que las células HeLa no estén fuera de la incubadora durante un período prolongado.

  1. El día después de la transfección, añadir 2 μL de CCCP de 5 o 20 mM (concentración final: 5 μM y 20 μM, respectivamente) a cada placa experimental. Para las placas de control, añadir 2 μL de DMSO. Devolver las placas a la incubadora deCO2 al 5% y 37 °C durante 1,5 h (Figura 1A).
    NOTA: El tratamiento CCCP es por un total de 2 h. Sin embargo, las mitocondrias se marcan con sondas fluorescentes durante los últimos 30 minutos del tratamiento con PCCC.
  2. Después de 1,5 h, retire las placas de la incubadora y agregue sondas fluorescentes a las placas de imágenes. Devolver las placas a la incubadora deCO2 al 5% y 37 °C durante 30 min (Figura 1A).
    1. Experimento TMRE: Añadir 2 μL de 25 μM MitoTracker (concentración final: 25 nM) y 2 μL de 10 μM TMRE (concentración final: 10 nM).
    2. Experimento MitoSOX: Añadir 2 μL de 25 μM MitoTracker (concentración final: 25 nM) y 1 μL de 5 mM MitoSOX (concentración final: 2,5 μM).
  3. Después del tratamiento con PCCC de 2 h, prepare las células HeLa para la obtención de imágenes (Figura 1A, B).
    1. Experimento TMRE: las células HeLa están inmediatamente listas para obtener imágenes; asegurarse de que el TMRE permanezca en los medios de cultivo celular HeLa.
    2. Experimento MitoSOX: Lave las células 3 veces con 2 ml de medios HeLa precalentados para eliminar el colorante MitoSOX libre. Agregue 2 ml de medios precalentados. Las células HeLa ahora están listas para obtener imágenes.
      NOTA: Lave las células HeLa con medios HeLa frescos y precalentados que contengan la misma concentración de DMSO o CCCP que la condición experimental; no incluya MitoSOX ni MitoTracker.

3. Configuración de adquisición de imágenes de microscopio confocal

NOTA: Imagen de las células HeLa usando un microscopio confocal (ver Tabla de materiales) equipado con un objetivo de inmersión en aceite de apertura numérica (NA) de 63x/1.40 y una cámara ambiental (ver Tabla de materiales).

  1. En 1 h antes de la toma de imágenes, encienda el CO2 abriendo la válvula del tanque. Pulse el botón On para encender el controlador ambiental del microscopio. Utilice las flechas hacia arriba y hacia abajo del panel táctil para ajustar la temperatura a 37 °C y el CO de2 a 5%. Pulse Establecer cuando haya terminado.
    NOTA: Asegúrese de que las puertas de la cámara ambiental estén cerradas y espere a que las condiciones se estabilicen.
  2. Configuración del láser
    1. Encienda el láser de luz blanca (WLL) y ajuste la potencia del láser al 85% y el control de excitación a la potencia máxima. Haga clic en la pestaña Adquirir , seleccione Agregar láser y, en el cuadro de diálogo que aparece, cambie WLL a Activado. Haga clic en el botón de encendido láser e ingrese 85%. Haga clic en el botón Control de excitación y seleccione Potencia máxima en el menú desplegable (Figura 2A).
    2. Experimento TMRE: Establezca los espectros de excitación y emisión para YFP, MitoTracker y TMRE.
      1. Para YFP, ajuste el láser de excitación a 514 nm y la ventana de espectros de emisión a 524-545 nm. En la pestaña Adquirir, haga clic en el botón Agregar nueva configuración; luego, haga clic en Agregar láser y arrástrelo a la Configuración 1. Haga doble clic en la Línea de excitación e introduzca 514 como longitud de onda en el cuadro de diálogo. Haga doble clic en el detector correspondiente e introduzca 524 para el principio y 545 para la longitud de onda final.
      2. Para MitoTracker Deep Red, ajuste el láser de excitación a 641 y la ventana de espectros de emisión a 650-750 nm. En la pestaña Adquirir, haga clic en el botón Agregar láser y arrástrelo a la Configuración 1. Haga doble clic en la línea de excitación e introduzca 641 como longitud de onda en el cuadro de diálogo. Haga doble clic en el detector correspondiente e introduzca 650 para el principio y 750 para la longitud de onda final.
      3. Para TMRE, ajuste el láser de excitación a 555 nm y la ventana de espectros de emisión a 557-643 nm. En la pestaña Adquirir, haga clic en el botón Agregar nueva configuración; luego, haga clic en el botón Agregar láser y arrástrelo a la Configuración 2. Haga doble clic en la Línea de excitación e introduzca 555 como longitud de onda en el cuadro de diálogo. Haga doble clic en el detector correspondiente e introduzca 557 para el principio y 643 para la longitud de onda final.
    3. Experimento MitoSOX: Establezca los espectros de excitación y emisión para YFP, MitoTracker y MitoSOX (Figura 2B).
      1. Para YFP, ajuste el láser de excitación a 507 nm y la ventana de espectros de emisión a 517-540 nm. En la pestaña Adquirir, haga clic en el botón Agregar nueva configuración; luego, haga clic en el botón Agregar láser y arrástrelo a la Configuración 1. Haga doble clic en la Línea de excitación e introduzca 507 como longitud de onda en el cuadro de diálogo. Haga doble clic en el detector correspondiente e introduzca 517 para el principio y 540 para la longitud de onda final.
      2. Para MitoSOX, ajuste el láser de excitación a 547 nm y la ventana de espectros de emisión a 564-636 nm. En la pestaña Adquirir , haga clic en el botón Agregar nueva configuración ; luego, haga clic en el botón Agregar láser y arrástrelo a la Configuración 2. Haga doble clic en la Línea de excitación e introduzca 547 como longitud de onda en el cuadro de diálogo. Haga doble clic en el detector correspondiente e introduzca 564 para el principio y 636 para la longitud de onda final.
      3. Para MitoTracker Deep Red, ajuste el láser de excitación a 641 nm y la ventana de espectros de emisión a 652-742 nm. En la pestaña Adquirir, haga clic en el botón Agregar nueva configuración; haga clic en el botón Agregar láser y arrástrelo a la Configuración 3. Haga doble clic en la línea de excitación e introduzca 641 como longitud de onda en el cuadro de diálogo. Haga doble clic en el detector correspondiente e introduzca 652 para el principio y 742 para la longitud de onda final.
  3. Configuración de adquisición de imágenes (Figura 2C)
    1. Establezca el formato en 1.024 x 1.024, la velocidad de escaneo en 600 Hz y el promedio de línea en 3.
      1. Seleccione la pestaña Adquisición y haga clic en el botón Formato . En el menú desplegable, seleccione 1,024 x 1,024. Haz clic en el botón Velocidad y selecciona 600 en el menú desplegable. Luego, haga clic en el botón Promedio de línea y, en el menú desplegable, seleccione 3.
      2. Active el escaneo bidireccional y establezca el factor de fase y zoom en 22,61 y 1,50, respectivamente.
        1. En la pestaña Adquisición, cambie el botón Bidireccional a Activado. Haga clic en la configuración de la Fase X y configúrela en 22.61. Haga clic en la configuración de Factor de zoom y configúrela en 1.50.

4. Adquisición de imágenes

PRECAUCIÓN: El experimentador debe hacer un juicio visual para seleccionar las células basándose en la señal de fluorescencia YFP. Evite los píxeles sobresaturados, ya que pueden afectar significativamente la cuantificación de la intensidad de fluorescencia. Utilice una tabla de búsqueda de más/menos que indique la saturación de píxeles para evitar la adquisición de imágenes saturadas.

  1. Haga clic en la configuración de interés y presione Fast Live para proporcionar una vista previa en vivo de la imagen de fluorescencia.
  2. Ajuste la ganancia y la intensidad haciendo doble clic en el detector correspondiente. En el cuadro de diálogo que aparece, ajuste la ganancia con el control deslizante. Para modificar la intensidad, haga doble clic en la Línea de excitación y utilice las flechas arriba y abajo en la ventana emergente para cambiar la intensidad. Haga clic en Detener para finalizar la vista previa.
    1. Experimento TMRE: Imagen primero de la placa de control DMSO. Ajustar la ganancia y la intensidad de la señal TMRE (Ajuste 2) para que la intensidad de la red mitocondrial esté justo por debajo de la saturación; Mantenga la ganancia y la intensidad constantes para el experimento. Ajuste la ganancia y la intensidad del MitoTracker y YFP (Ajuste 1) para que la red mitocondrial sea visible pero tenue.
    2. Experimento MitoSOX: Imagen de la placa de control DMSO primero. Ajuste la ganancia y la intensidad de la señal MitoSOX (Ajuste 2) para que la fluorescencia sea visible pero tenue; Mantenga la ganancia y la intensidad constantes para el experimento. Ajuste la ganancia y la intensidad del YFP (Ajuste 1) y MitoTracker (Ajuste 3) para que la red mitocondrial sea visible pero tenue.
      NOTA: Registre la ganancia y la intensidad de TMRE y MitoSOX, ya que estos valores deben permanecer constantes durante todo el experimento. Las señales de fluorescencia de YFP y MitoTracker no se cuantifican en este protocolo. Por lo tanto, la ganancia y la intensidad se pueden ajustar para cada imagen. Es más efectivo tener los ajustes de ganancia e intensidad donde las células son fáciles de ver pero aún tenues, para garantizar que las células no estén expuestas a intensidades excesivas de láser que causen daño celular o fotoblanqueo.
  3. Una vez completados los ajustes de ganancia e intensidad, haga clic en Iniciar para adquirir una imagen. Adquirir imágenes de 20 células por condición experimental (por ejemplo, cinco imágenes con cuatro celdas por imagen; Figura 2D).

5. Cuantificación de la intensidad de fluorescencia usando ImageJ

NOTA: Los archivos de imágenes se guardan como ".lif" y son compatibles con ImageJ29. Los tipos de archivo compatibles con ImageJ se especifican en su sitio web. Puede ser necesario convertir el tipo de archivo si es incompatible.

  1. Crear y guardar una región de interés (ROI).
    1. En ImageJ, haga clic en Archivo | Nuevo | Imagen. En el cuadro de diálogo que aparece, haga clic en Aceptar.
    2. Haga clic en el botón Herramienta rectangular y dibuje una caja de 6 micras x 6 micras. Abra el administrador de ROI haciendo clic en Analizar | Herramientas | ROI Manager y espere a que aparezca un cuadro de diálogo con el ROI Manager (Figura 3A). Agregue el ROI rectangular al administrador haciendo clic en Agregar en el cuadro de diálogo del administrador. Guarde el ROI seleccionando Más, luego haga clic en el botón Guardar y OK.
  2. Mide la intensidad de la fluorescencia.
    1. En la imagen J, haga clic en Archivo y seleccione Abrir. En el cuadro de diálogo, seleccione los archivos de imágenes para el experimento y haga clic en Abrir.
    2. Espere a que aparezca la ventana Opciones de importación de bioformatos (Figura 3B). Seleccione Dividir canales y haga clic en Abrir.
      NOTA: La función de canales divididos permite que cada canal de la imagen se abra como una ventana separada. El orden de canal corresponde a la orden de adquisición.
      1. Experimentos TMRE : YFP (Ajuste 1) es el primer canal (c = 0); MitoTracker (Ajuste 1) es el segundo canal (c = 1); y TMRE (Ajuste 2) es el tercer canal (c = 2).
      2. Experimentos MitoSOX : YFP (Ajuste 1) es el primer canal (c = 0); MitoSOX (Ajuste 2) es el segundo canal (c = 1); y MitoTracker (Ajuste 3) es el tercer canal (c = 2).
    3. Ajuste el brillo seleccionando Imagen | Ajustar | Brillo (Figura 3C).
      NOTA: No pulse Establecer o Aplicar para asegurarse de que el brillo de la imagen no se altere permanentemente. Ocasionalmente, la intensidad de fluorescencia no es visible en los canales TMRE o MitoSOX. Ajuste el brillo para permitir una visualización más fácil. La alteración del brillo no afecta a los valores brutos de intensidad de fluorescencia.
    4. Haga clic en Analizar y seleccione Establecer medidas. Marque las casillas Área y Valor gris medio y haga clic en Aceptar (Figura 3D).
      NOTA: El valor gris medio es la intensidad de fluorescencia.
    5. Abra el Administrador de ROI y cargue el ROI guardado en el paso 5.1 haciendo clic en Analizar | Herramientas | Gerente de ROI. En el Administrador de ROI, haga clic en Más, luego en Abrir en la lista que aparece y seleccione el ROI guardado.
    6. Mida la intensidad de fluorescencia de cinco regiones aleatorias en una sola celda seleccionando el ROI guardado del administrador de ROI y mueva el ROI a una ubicación aleatoria dentro de una celda (Figura 3E). Mida la intensidad de fluorescencia presionando M. Repita este paso con cuatro regiones adicionales no superpuestas. Cuando aparezca un cuadro de diálogo con el área y los valores grises medios (Figura 3F), copie y pegue los valores en una hoja de cálculo para su análisis.
      1. Experimento TMRE : Seleccionar imagen (c = 2).
      2. Experimento MitoSOX : Seleccione la imagen (c = 2).
    7. Obtener los valores medios de intensidad de fluorescencia. Usando un software de hoja de cálculo (consulte la Tabla de materiales), promedie los cinco valores grises medios. Repita este proceso para cada celda.
    8. Analizar y comparar los valores grises medios de TMRE o MitoSOX en condiciones experimentales utilizando un programa de software estadístico (ver Tabla de materiales; Figura 4 y Figura 5). Presentar datos como gráficos de barras o diagramas de violín.

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Representative Results

En este protocolo, se utilizó la cuantificación basada en fluorescencia para medir el potencial de membrana y los niveles de superóxido de la red mitocondrial después del tratamiento con CCCP (Figura 1). Este flujo de trabajo utilizó células HeLa, una línea celular inmortalizada derivada del cáncer cervical. Las células HeLa se utilizan rutinariamente para estudiar la biología mitocondrial y son relativamente planas, lo que facilita la visualización de la red mitocondrial mediante microscopía. Para investigar el papel de Parkin en el mantenimiento de la salud de la red mitocondrial, las células HeLa se transfectaron transitoriamente con un vector de control vacío, ParkinWT o ParkinT240R (un mutante que interrumpe la mitofagia)21. Las células HeLa se colocaron en placas de imágenes con fondo de vidrio de 35 mm y se transfectaron una vez que se alcanzó una confluencia de ~ 50% -60% (Figura 1A). Dado que las células HeLa se dividen rápidamente, esto es típicamente el día después de colocar las células en las placas de imágenes. Se utilizó un microscopio de luz para observar la señal de fluorescencia YFP al día siguiente para evaluar la eficiencia de la transfección. Los experimentos solo se realizaron después de una transfección exitosa.

Después de la inspección, las células HeLa se trataron con concentraciones leves (5 μM) o graves (20 μM) de PCCC para despolarizar la red mitocondrial (el paso 1.2 muestra instrucciones detalladas para preparar PCCC y sondas fluorescentes). El tratamiento CCCP se realizó durante un total de 2 h. Durante los últimos 30 minutos del tratamiento con CCCP, las mitocondrias se marcaron con MitoTracker y TMRE/MitoSOX (Figura 1A). Cabe señalar que TMRE y MitoSOX tienen espectros de fluorescencia superpuestos y no se pueden usar simultáneamente. En su lugar, utilizamos platos de imagen separados para los experimentos TMRE y MitoSOX. Para los experimentos de TMRE, las células HeLa estaban inmediatamente listas para obtener imágenes al final del tratamiento CCCP de 2 h. La concentración de TMRE debe permanecer constante; por lo tanto, TMRE permaneció en los medios de comunicación HeLa. Sin embargo, MitoSOX libre debe eliminarse antes de la obtención de imágenes. Para los experimentos MitoSOX, las células se lavaron tres veces con medios HeLa para eliminar el tinte libre. Para este paso, es esencial utilizar medios HeLa que contengan la misma concentración de DMSO o CCCP que las condiciones experimentales. Hoechst 33342, un marcador de núcleos, se utilizó inicialmente para evaluar las células HeLa después de la transfección transitoria y el tratamiento con CCCP (Figura 1B).

Posteriormente, se realizó microscopía confocal para visualizar las intensidades de fluorescencia TMRE y MitoSOX, para medir el potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido, respectivamente. Las imágenes se adquirieron utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63x (1.4 NA) con parámetros de escaneo bidireccional, una resolución espacial de 1,024 x 1,024 píxeles, una velocidad de escaneo de 600 Hz, un promedio de línea de 3, una fase de 22.61 y un factor de zoom de 1.5 (Figura 2C). La placa de control DMSO se visualizó primero para todos los experimentos para establecer los valores de ganancia e intensidad para TMRE y MitoSOX. Para hacer comparaciones cuantitativas entre condiciones, estos valores deben establecerse en la condición DMSO y permanecer constantes durante todo el experimento. CCCP induce la despolarización mitocondrial y una pérdida de potencial de membrana, lo que resulta en una intensidad de fluorescencia TMRE reducida. Por lo tanto, los experimentos de control tuvieron la mayor intensidad de TMRE, y los valores de ganancia e intensidad se establecieron cerca de la saturación. Por el contrario, los niveles más altos de superóxido aumentan la intensidad de MitoSOX. Por lo tanto, el control tuvo la intensidad de fluorescencia MitoSOX más baja, y los valores de ganancia e intensidad se establecieron bajos donde había una señal tenue. Dado que MitoTracker, TMRE y MitoSOX son colorantes vitales y etiquetan todas las células, no deben usarse al seleccionar células para obtener imágenes. En cambio, las células se seleccionaron en función de la señal YFP para garantizar que fueran transfectadas. Se adquirieron imágenes de un solo plano, centrándose en la parte inferior de la célula HeLa, donde se encontraba una gran población de mitocondrias.

Cuantificación de la intensidad de fluorescencia TMRE y MitoSOX
La cuantificación de las intensidades de fluorescencia TMRE y MitoSOX se analizó utilizando ImageJ (Figura 3). Se creó un ROI de 6 micras x 6 micras y se almacenó en el administrador de ROI. El ROI se colocó en cinco regiones aleatorias no superpuestas de cada célula para medir la intensidad de TMRE o MitoSOX. La intensidad de fluorescencia corresponde al valor gris medio en ImageJ. Los cinco valores de intensidad se promediaron para cada celda para calcular la intensidad media de fluorescencia por celda. Estos valores se trazaron y analizaron para determinar la significación estadística en todas las condiciones de tratamiento.

Los resultados para las intensidades de fluorescencia TMRE y MitoSOX se muestran en la Figura 4 y la Figura 5, respectivamente. Como era de esperar, el tratamiento con el conocido agente de desacoplamiento CCCP disminuyó la intensidad de fluorescencia TMRE en comparación con las condiciones de control (Figura 4A, B). Además, el tratamiento severo (20 μM) con CCCP indujo la producción de superóxido y aumentó la intensidad de fluorescencia de MitoSOX (Figura 5A, B). En condiciones de estrés CCCP leves (5 μM), la expresión de ParkinWT y ParkinT240R resultó en una mayor intensidad de TMRE en comparación con el vector de control YFP vacío. Del mismo modo, la intensidad de MitoSOX fue menor en las células que expresan ParkinWT y ParkinT240R en comparación con las células que expresan el vector de control YFP (Figura 5A, B). Estos resultados sugieren que la expresión de Parkin ayuda a mantener la salud de la red mitocondrial al preservar potenciales de membrana mitocondrial más altos y bajos niveles de superóxido. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí se puede utilizar para comparar con precisión la intensidad de fluorescencia para analizar el papel de Parkin en el control del potencial de membrana mitocondrial y la formación de superóxido.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo experimental. (A) Esquema del flujo de trabajo experimental utilizado para transfectar, tratar con CCCP y etiquetar la red mitocondria, e imagen de la intensidad de fluorescencia TMRE y MitoSOX en células HeLa. (B) Imágenes representativas de células que expresan un vector YFP vacío (arriba), YFP-ParkinWT (centro) y YFP-ParkinT240R (abajo; magenta). Hoechst 33342 (blanco) se utiliza para etiquetar el ADN. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: CCCP = cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona; TMRE = tetrametilrodamina-éster etílico-perclorato; YFP = proteína fluorescente amarilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La interfaz de usuario para configurar la configuración de adquisición confocal . (A) Cuadro de diálogo Configuración del láser. El rectángulo rojo resalta el láser de luz blanca, el estado de potencia, la potencia del láser y las longitudes de onda. (B) Canal experimental configurado para un experimento MitoSOX. La configuración, las líneas de excitación y las ventanas de espectros de emisión se muestran para YFP, MitoSOX y MitoTracker. (C) Los ajustes de adquisición muestran el formato, la velocidad, la bidireccionalidad, la fase X, el factor de zoom y el promedio de línea. (D) Una imagen adquirida representativa. Las células HeLa expresan YFP (magenta), y las mitocondrias están marcadas con MitoSOX (verde) y MitoTracker (cian). Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: WLL = láser de luz blanca; YFP = proteína fluorescente amarilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Flujo de trabajo de ImageJ para cuantificar las intensidades de fluorescencia TMRE y MitoSOX. (A) El panel del administrador de ROI con un ejemplo de ROI en ImageJ. (B) Panel de opciones de importación de bioformatos. El rectángulo rojo resalta la opción Dividir canales que debe seleccionarse. (C) Parámetros de ajuste de brillo y contraste. (D) Establecer el parámetro de mediciones. Los rectángulos rojos resaltan las opciones de valor de área y gris medio que deben seleccionarse. (E) Imagen representativa de una célula HeLa etiquetada con MitoSOX. El cuadrado rojo ilustra el ROI del panel A. Barra de escala = 10 μm. (F) Panel de resultados que muestra el área experimental y los valores grises medios de los ROI. El valor gris medio (naranja) representa los valores de intensidad de fluorescencia. Abreviaturas: TMRE = tetrametilrodamina-éster etílico-perclorato; ROI = región de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Intensidad de fluorescencia TMRE después del daño mitocondrial. (A) Imágenes representativas de células HeLa después de un tratamiento de 2 h con DMSO, CCCP de 5 μM o CCCP de 20 μM para inducir daño mitocondrial. Las células expresan exógenamente un vector YFP vacío, YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R (magenta), y están marcadas con MitoTracker (cian) y TMRE (verde). Barra de escala = 30 μm. (B) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia TMRE para células que expresan vector YFP vacío (azul), YFP-ParkinWT (naranja) y YFP-ParkinT240R (púrpura) en condiciones tratadas con DMSO y CCCP. p < 0,0001 por ANOVA bidireccional con una prueba de comparación múltiple. (C-E) La cuantificación de las intensidades de fluorescencia TMRE del panel B se separa para resaltar las diferencias en DMSO (C), 5 μM CCCP (D) y 20 μM CCCP (E). * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001 por Kruskal-Wallis ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Dunn. Ns = no significativo. Media ± SEM; n= 79-104 a partir de tres réplicas biológicas independientes. Abreviaturas: CCCP = cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona; TMRE = tetrametilrodamina-éster etílico-perclorato; YFP = proteína fluorescente amarilla; DMSO = dimetilsulfóxido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Intensidad de fluorescencia de MitoSOX después del daño a la red mitocondrial. (A) Imágenes representativas de células HeLa tratadas durante 2 h con DMSO, CCCP de 5 μM o CCCP de 20 μM para desacoplar el potencial de membrana de las mitocondrias. Las células se transfectaron con el vector YFP vacío, YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R (magenta), y se marcaron con MitoTracker (cian) y MitoSOX (verde). Barra de escala = 30 μm. (B) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de MitoSOX para células que expresan vector YFP vacío (azul), YFP-ParkinWT (naranja) y YFP-ParkinT240R (púrpura) para condiciones de control y tratamiento. p < 0,0001 por ANOVA bidireccional con la prueba de comparación múltiple de Dunn. (C-E) La cuantificación de las intensidades de fluorescencia de MitoSOX del panel B se separa para resaltar las diferencias en DMSO (C), 5 μM CCCP (D) y 20 μM CCCP (E). *p < 0,05; p < 0,0001 por Kruskal-Wallis ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Dunn. Ns = no significativo. Media ± SEM; n = 87-107 a partir de tres réplicas biológicas independientes. Abreviaturas: CCCP = cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona; TMRE = tetrametilrodamina-éster etílico-perclorato; YFP = proteína fluorescente amarilla; DMSO = dimetilsulfóxido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El flujo de trabajo descrito aquí se puede utilizar para cuantificar el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido de forma robusta y reproducible utilizando imágenes basadas en fluorescencia30. Existen importantes limitaciones técnicas a considerar al diseñar estos experimentos. Las células HeLa se transfectaron con un vector YFP vacío, YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R. El vector YFP vacío se utilizó como control para confirmar que los hallazgos experimentales eran específicos de Parkin. Para la transfección transitoria, se determinó experimentalmente una relación de masa de 1:3 para el ADN al reactivo de transfección para producir la tasa de transfección más alta, donde se utilizaron 2 μg de ADN plásmido para cada construcción28. Mantener la etiqueta YFP consistente para todas las construcciones fue importante, ya que las proteínas fluorescentes difieren en el brillo innato31,32. Si se deben usar múltiples etiquetas de proteínas fluorescentes, entonces se deben seleccionar proteínas fluorescentes con brillo y fotoestabilidad similares33.

Para medir el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido, se seleccionaron dos colorantes bien documentados. La señal de fluorescencia de TMRE se basa en el potencial de la membrana mitocondrial, mientras que la intensidad de fluorescencia de MitoSOX es una función de los niveles de superóxido. Para las imágenes basadas en fluorescencia, no debe haber superposición espectral entre las sondas fluorescentes. Sin embargo, el protocolo inicial se realizó utilizando mCherry-ParkinWT y mCherry-ParkinT240R, que se superpusieron con los espectros desplazados al rojo de TMRE y MitoSOX. Para evitar la superposición espectral y minimizar la posible diafonía, se seleccionaron construcciones Parkin etiquetadas con YFP. Este ajuste requirió alterar el tinte MitoTracker de verde a rojo lejano. Además, se optimizó la densidad del recubrimiento celular HeLa; inicialmente, las células HeLa se colocaron en 45,000 células por placa de imagen, pero esto resultó en placas demasiado confluentes. La alta confluencia celular puede reducir la eficiencia de la transfección, promover la muerte celular y alterar el metabolismo celular34,35,36. Para evitar estos impactos potenciales, las células se colocaron en una densidad de 30,000 células por plato de imágenes.

La principal limitación de este protocolo es el potencial de sesgo del usuario, específicamente al seleccionar celdas y ubicaciones de ROI. El protocolo utiliza cambios en las intensidades de fluorescencia TMRE y MitoSOX como una lectura funcional para el potencial de membrana y los niveles de superóxido. Por lo tanto, la selección celular utilizando estas sondas podría sesgar los resultados experimentales. Para combatir este sesgo, elegimos células basadas únicamente en la expresión de YFP. Los ROI no superpuestos se seleccionaron aleatoriamente a través de la red mitocondrial dentro de la célula. Aunque este método se utilizó anteriormente para medir la intensidad de fluorescencia27, se podrían tomar medidas adicionales de reducción del sesgo. Primero, el estudio podría ser cegado usando las Herramientas de Análisis Ciego en ImageJ para evitar la selección de ROI que respalda los resultados esperados. En segundo lugar, las intensidades de fluorescencia podrían medirse utilizando un software avanzado de análisis de imágenes que elimina la necesidad de ROI.

Si bien este protocolo utiliza microscopía confocal para la cuantificación basada en fluorescencia, se podrían usar métodos adicionales, como la citometría de flujo, para cuantificar los cambios de fluorescencia en TMRE y MitoSOX37. Aquí, utilizamos microscopía confocal en lugar de citometría de flujo para visualizar la morfología de la red mitocondrial. El protocolo descrito podría adaptarse fácilmente para medir la fluorescencia TMRE y MitoSOX con citometría de flujo que arroje resultados experimentales similares. Además, los ensayos de tasa de consumo de oxígeno (OCR) podrían usarse para detectar cambios en la función de la cadena de transporte de electrones mitocondriales sin colorantes catiónicos. Mientras que la OCR proporciona una medida sensible de la disfunción mitocondrial, no es específica del potencial de membrana o de la concentración de superóxido, sino que proporciona una medida global de la función mitocondrial38. Estos ensayos podrían realizarse en conjunto con experimentos TMRE y MitoSOX para evaluar la salud mitocondrial39.

Aunque este protocolo se centra específicamente en el efecto del desacoplador mitocondrial CCCP40, se podrían utilizar reactivos dañinos con mecanismos alternativos. Por ejemplo, la antimicina A y la oligomicina A son inhibidores de la cadena de transporte de electrones comúnmente utilizados para inducir daño mitocondrial a través de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)38. Si bien medimos específicamente los niveles de superóxido mitocondrial usando MitoSOX, las ROS intracelulares podrían medirse usando CellROX. En las células HeLa, fue necesario sobreexpresar Parkin debido a la baja expresión endógena. Estudios futuros podrían observar los efectos de la expresión de Parkin en la salud de la red mitocondrial utilizando sistemas de cultivo celular que expresan Parkinendógeno 41. Dado que las mitocondrias son reguladores críticos del metabolismo energético y la homeostasis celular, la disfunción mitocondrial se asocia con numerosas enfermedades, incluyendo diabetes42, enfermedad de Alzheimer 43,44,45, cáncer 46 y enfermedad hepática 47. Por lo tanto, este flujo de trabajo podría adaptarse para estudiar la salud mitocondrial y la desregulación en líneas celulares relevantes y cultivos primarios.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses contrapuestos que declarar.

Acknowledgments

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Evans por sus comentarios reflexivos sobre este manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo de Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars y Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. La Figura 1A se realizó utilizando BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)  Sigma-Aldrich C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose Gibco 11-965-084
DMSO, Anhydrous ThermoFisher Scientific D12345
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) Promega E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)  Gibco  35-050-061
Hoescht 33342 ThermoFisher Scientific 62249
MitoSOX  Red  ThermoFisher Scientific M36008
MitoTracker Deep Red ThermoFisher Scientific M7514
Opti-MEM (Redued Serum media) ThermoFisher scientific 31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)  ThermoFisher Scientific T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens) A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector N/A N/A
YFP-Parkin T240R This Paper Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT Addgene; PMID:19029340 RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator Adobe Inc. https://www.adobe.com/products/illustrator (Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software) Microsoft Office  https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X) Leica https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel Microsoft Office https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software) GraphPad Software https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated MatTek P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber) Okolab https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope Leica N/A
LIGHTNING Deconvolution Software Leica N/A
STELLARIS 8 confocal microscope Leica N/A

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References

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Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa
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Fazli, M., Evans, C. S.… More

Fazli, M., Evans, C. S. Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells. J. Vis. Exp. (195), e65304, doi:10.3791/65304 (2023).

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