Функциональная сайт-направленная флуорометрия в нативных клетках для изучения возбудимости скелетных мышц
Summary
Функциональная сайт-направленная флуорометрия — это метод изучения движений белковых доменов в режиме реального времени. Модификация этого метода для его применения в нативных клетках теперь позволяет обнаруживать и отслеживать движения одного датчика напряжения из потенциал-зависимых каналов Ca2+ в изолированных волокнах скелетных мышц мышей.
Abstract
Функциональная сайт-направленная флуорометрия была методом выбора для исследования взаимосвязи структуры и функции многочисленных мембранных белков, включая потенциал-зависимые ионные каналы. Этот подход использовался в основном в гетерологичных экспрессионных системах для одновременного измерения мембранных токов, электрического проявления активности каналов и измерений флуоресценции, сообщая о локальных доменных перестройках. Функциональная сайт-направленная флуорометрия объединяет электрофизиологию, молекулярную биологию, химию и флуоресценцию в единый широкомасштабный метод, который позволяет изучать структурные перестройки и функции в реальном времени посредством флуоресценции и электрофизиологии соответственно. Как правило, для этого подхода требуется спроектированный потенциал-зависимый мембранный канал, содержащий цистеин, который может быть протестирован тиол-реактивным флуоресцентным красителем. До недавнего времени тиол-реакционноспособная химия, используемая для сайт-направленного флуоресцентного мечения белков, проводилась исключительно в ооцитах и клеточных линиях Xenopus , что ограничивало сферу применения подхода первичными невозбудимыми клетками. В этом отчете описывается применимость функциональной сайт-направленной флуорометрии в клетках скелетных мышц взрослого человека для изучения ранних этапов связи возбуждения-сокращения, процесса, посредством которого электрическая деполяризация мышечных волокон связана с активацией мышечного сокращения. В настоящем протоколе описываются методики проектирования и трансфектирования цистеин-инженерных потенциал-зависимых каналов Ca2+ (CaV1.1) в мышечные волокна сгибателя пальцев взрослых мышей с использованием электропорации in vivo , а также последующие этапы, необходимые для функциональных сайт-направленных флуорометрических измерений. Этот подход может быть адаптирован для изучения других ионных каналов и белков. Использование функциональной сайт-направленной флюорометрии мышц млекопитающих особенно актуально для изучения основных механизмов возбудимости.
Introduction
Способность отслеживать конформационные перестройки ионных каналов в ответ на известный электрический стимул в живой клетке является источником ценной информации для молекулярной физиологии1. Потенциал-зависимые ионные каналы представляют собой мембранные белки, которые ощущают изменения трансмембранного напряжения, и на их функцию также влияют изменения напряжения2. Развитие методов зажима напряжения в прошлом веке позволило физиологам изучать в режиме реального времени ионные токи, переносимые потенциал-зависимыми ионными каналами в ответ на деполяризацию мембраны3. Использование технологии зажима напряжения имеет решающее значение для понимания электрических свойств возбудимых клеток, таких как нейроны и мышцы. В 1970-х годах уточнение зажима напряжения позволило обнаружить стробирующие токи (или движение заряда) в потенциал-зависимых каналахкальция (Ca V) и натрия (NaV) 4,5. Стробирующие токи представляют собой нелинейные емкостные токи, возникающие в результате движения датчиков напряжения в ответ на изменения электрического поля через клеточную мембрану6. Стробирующие токи считаются электрическим проявлением молекулярных перегруппировок, которые предшествуют или сопровождают открытие ионного канала7. Хотя эти измерения тока дают ценную информацию о функции канала, как ионные токи, так и стробирующие токи являются косвенными показаниями меж- и внутримолекулярных конформационных перестроек потенциал-зависимых каналов7.
Функциональная сайт-направленная флуорометрия (FSDF; также называемая флюорометрия зажима напряжения, VCF) была разработана в начале 1990-х годов8 и впервые предоставила возможность непосредственно просматривать локальные конформационные изменения и функцию канального белка в режиме реального времени. Используя комбинацию систем мутагенеза каналов, электрофизиологии и гетерологичной экспрессии, можно флуоресцентно помечать и отслеживать движущиеся части определенных каналов или рецепторов в ответ на активирующий стимул 9,10. Этот подход широко использовался для изучения механизмов измерения напряжения в потенциал-зависимых ионных каналах 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Авторитетные обзоры см. в 10,20,21,22,23.
Каналы CaV и NaV, критически важные для инициирования и распространения электрических сигналов, состоят из главной субъединицы α1, которая обладает центральной порой и четырьмя неидентичными доменамиизмерения напряжения 2. В дополнение к их отчетливой первичной структуре, каналы Ca V и NaV выражаются в виде мультисубъединичных комплексов со вспомогательными субъединицами24. Потенциал-зависимые калиевые каналы (K V) состоят из четырех субъединиц, которые выглядят как один домен Na V или CaV25. Порообразующая и чувствительная к напряжению α1-субъединица каналов CaV и NaV образована одним полипептидом, кодирующим четыре отдельных домена из шести уникальных трансмембранных сегментов (S1-S6; Рисунок 1А) 24,26. Область, состоящая из трансмембранных сегментов от S1 до S4, образует чувствительный к напряжению домен (VSD), а трансмембранные сегменты S5 и S6 образуют поровый домен26. В каждом VSD α-спираль S4 содержит положительно заряженный аргинин или лизин (рис. 1A, B), которые движутся в ответ на деполяризациюмембраны 7. Несколько десятилетий исследований и результаты самых разных экспериментальных подходов подтверждают предположение о том, что сегменты S4 движутся наружу, генерируя стробирующие токи, в ответ на деполяризацию мембраны6.
FSDF измеряет флуоресцентные изменения тиол-реактивного красителя, конъюгированного со специфическим остатком цистеина (т.е. α-спиралью S4) на ионном канале или другом белке, сконструированном посредством сайт-направленного мутагенеза, поскольку канал функционирует в ответ на деполяризацию мембраны или другие стимулы10. Фактически, FSDF был первоначально разработан для исследования того, перемещается ли сегмент S4 в каналах KV, предлагаемый в качестве основного датчика напряжения канала, при движении стробирующих зарядов в ответ на изменения мембранного потенциала 8,10. В случае потенциал-зависимых ионных каналов FSDF может разрешать независимые конформационные перегруппировки четырех VSD (отслеживая один VSD в любой момент времени) одновременно с измерениями функции канала. Действительно, используя этот подход, было показано, что отдельные ДМЖП, по-видимому, по-разному участвуют в конкретных аспектах активации и инактивации канала 12,27,28,29,30. Идентификация вклада каждой ДМЖП в функцию каналов имеет большое значение и может быть использована для дальнейшего выяснения работы канала и, возможно, выявления новых мишеней для разработки лекарств.
Использование FSDF в гетерологичных системах экспрессии было чрезвычайно полезным для дальнейшего понимания функции канала с редукционистской точки зрения10,23. Как и многие редукционистские подходы, он имеет преимущества, но также имеет ограничения. Например, одним из основных ограничений является частичное восстановление наносреды канала в гетерологичной системе. Часто ионные каналы взаимодействуют с многочисленными вспомогательными субъединицами и многими другими белками, которые изменяют их функцию31. В принципе, различные каналы и их вспомогательные субъединицы могут быть экспрессированы в гетерологичных системах с использованием множественных белковых кодирующих конструкций или полицистронных плазмид, но их нативная среда не может быть полностью восстановлена30,32.
Наша группа недавно опубликовала вариант FSDF в нативных диссоциированных скелетных мышечных волокнах для изучения ранних стадий связи возбуждения-сокращения (ECC)33,34, процесса, посредством которого электрическая деполяризация мышечных волокон связана с активацией мышечного сокращения 35,36. Впервые этот подход позволил отслеживать движение отдельных датчиков напряжения S4 из управляемого напряжением канала Ca2+ L-типа (CaV1.1, также известного как DHPR) в нативной среде взрослого дифференцированного мышечного волокна37. Это было достигнуто путем рассмотрения множества характеристик этого типа клеток, включая электрическую активность клетки, обеспечивающую быструю самораспространяющуюся деполяризацию, индуцированную стимуляцией, способность экспрессировать плазмиду кДНК посредством электропорации in vivo, естественную высокую экспрессию и компартментную организацию каналов внутри клетки, а также ее совместимость с высокоскоростными устройствами визуализации и электрофизиологической записи. Ранее мы использовали высокоскоростной конфокальный микроскоп с линейным сканированием в качестве детектирующего устройства37. Теперь представлена разновидность методики с использованием фотодиода для сбора сигнала. Эта система детектирования на основе фотодиодов может облегчить внедрение этого метода в других лабораториях.
Здесь описан пошаговый протокол использования FSDF в нативных ячейках для исследования движения индивидуального датчика напряжения от CaV1.1. В то время как канал CaV1.1 использовался в качестве примера в этой рукописи, этот метод может быть применен к внеклеточнодоступным доменам других ионных каналов, рецепторов или поверхностных белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь описан пошаговый протокол проведения FSDF в мышечных волокнах для исследования движений отдельных датчиков напряжения от канала CaV1.1. Несмотря на то, что количество этапов и разнообразие подходов, которые сочетаются в этой технике, могут показаться сложными, большинство из э?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Джей Вергару (Калифорнийский университет, Лос-Анджелес) за то, что он поделился плазмидой дикого типа EGFP-CaV1.1 (кролик). Мы благодарим лабораторию электроники Йельского факультета физиологии и особенно Хенрика Абильдгаарда за проектирование и создание фотодиода с дорожкой и цепью удержания. Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения R01-AR075726 и R01-NS103777
Materials
| Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
| 0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
| 1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
| 1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
| 35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
| 60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
| Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
| Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
| Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
| Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
| BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
| collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
| Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
| Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
| EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
| Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
| EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
| FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated |
| glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
| Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
| Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
| Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
| Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
| LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
| Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
| MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
| OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
| Photodiode | Custom Made | NA | |
| PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
| Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacyte field stimulation electrode |
| Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
| Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
| Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
| S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
| Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
| Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
| Voltage generator | Custom Made | NA |
References
- Catterall, W. A., Wisedchaisri, G., Zheng, N. The chemical basis for electrical signaling. Nature Chemical Biology. 13 (5), 455-463 (2017).
- Armstrong, C. M., Hille, B. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron. 20 (3), 371-380 (1998).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Armstrong, C. M., Bezanilla, F. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature. 242 (5398), 459-461 (1973).
- Schneider, M. F., Chandler, W. K. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-contraction coupling. Nature. 242 (5395), 244-246 (1973).
- Bezanilla, F. Gating currents. The Journal of General Physiology. 150 (7), 911-932 (2018).
- Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiological Reviews. 80 (2), 555-592 (2000).
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Akabas, M. H. Cysteine modification: probing channel structure, function and conformational change. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 25-54 (2015).
- Priest, M., Bezanilla, F. Functional site-directed fluorometry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 55-76 (2015).
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
- Pantazis, A., Savalli, N., Sigg, D., Neely, A., Olcese, R. Functional heterogeneity of the four voltage sensors of a human L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 18381-18386 (2014).
- Savalli, N., Kondratiev, A., Toro, L., Olcese, R. Voltage-dependent conformational changes in human Ca(2+)- and voltage-activated K(+) channel, revealed by voltage-clamp fluorometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (33), 12619-12624 (2006).
- Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
- Bannister, J. P. A., Chanda, B., Bezanilla, F., Papazian, D. M. Optical detection of rate-determining ion-modulated conformational changes of the ether-à-go-go K+ channel voltage sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (51), 18718-18723 (2005).
- Bruening-Wright, A., Elinder, F., Larsson, H. P. Kinetic relationship between the voltage sensor and the activation gate in spHCN channels. The Journal of General Physiology. 130 (1), 71-81 (2007).
- Osteen, J. D., et al. KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22710-22715 (2010).
- Smith, P. L., Yellen, G. Fast and slow voltage sensor movements in HERG potassium channels. The Journal of General Physiology. 119 (3), 275-293 (2002).
- Gonzalez, C., Koch, H. P., Drum, B. M., Larsson, H. P. Strong cooperativity between subunits in voltage-gated proton channels. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 51-56 (2010).
- Gandhi, C. S., Olcese, R. The voltage-clamp fluorometry technique. Methods in Molecular Biology. 491, 213-231 (2008).
- Horne, A. J., Fedida, D. Use of voltage clamp fluorimetry in understanding potassium channel gating: a review of Shaker fluorescence data. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 87 (6), 411-418 (2009).
- Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
- Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. The Journal of General Physiology. 151 (10), 1163-1172 (2019).
- Catterall, W. A., Lenaeus, M. J., Gamal El-Din, T. M. Structure and pharmacology of voltage-gated sodium and calcium channels. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 60, 133-154 (2020).
- MacKinnon, R. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature. 350 (6315), 232-235 (1991).
- Wu, J., et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 Å resolution. Nature. 537 (7619), 191-196 (2016).
- Capes, D. L., Goldschen-Ohm, M. P., Arcisio-Miranda, M., Bezanilla, F., Chanda, B. Domain IV voltage-sensor movement is both sufficient and rate limiting for fast inactivation in sodium channels. The Journal of General Physiology. 142 (2), 101-112 (2013).
- Cha, A., Ruben, P. C., George, A. L., Fujimoto, E., Bezanilla, F. Voltage sensors in domains III and IV, but not I and II, are immobilized by Na+ channel fast inactivation. Neuron. 22 (1), 73-87 (1999).
- Muroi, Y., Arcisio-Miranda, M., Chowdhury, S., Chanda, B. Molecular determinants of coupling between the domain III voltage sensor and pore of a sodium channel. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (2), 230-237 (2010).
- Savalli, N., et al. The distinct role of the four voltage sensors of the skeletal CaV1.1 channel in voltage-dependent activation. The Journal of General Physiology. 153 (11), e202112915 (2021).
- Muller, C. S., et al. Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (34), 14950-14957 (2010).
- Perni, S., Lavorato, M., Beam, K. G. De novo reconstitution reveals the proteins required for skeletal muscle voltage-induced Ca2+ release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (52), 13822-13827 (2017).
- Beam, K. G., Horowicz, P. . Excitation-Contraction Coupling in Skeletal Muscle. , (2004).
- Schneider, M. F., Hernandez-Ochoa, E. O. . Muscle: Fundamental Biology and Mechanisms of Disease. , 811-822 (2012).
- Rios, E., Pizarro, G. Voltage sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiological Reviews. 71 (3), 849-908 (1991).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage sensing mechanism in skeletal muscle excitation-contraction coupling: coming of age or midlife crisis. Skeletal Muscle. 8 (1), 22 (2018).
- Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of CaV1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (40), e2026116118 (2021).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1520 (2009).
- Blunck, R., Starace, D. M., Correa, A. M., Bezanilla, F. Detecting rearrangements of shaker and NaChBac in real-time with fluorescence spectroscopy in patch-clamped mammalian cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3966-3980 (2004).
- Liu, Y., Carroll, S. L., Klein, M. G., Schneider, M. F. Calcium transients and calcium homeostasis in adult mouse fast-twitch skeletal muscle fibers in culture. The American Journal of Physiology. 272 (6), C1919-C1927 (1997).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Vanegas, C., Iyer, S. R., Lovering, R. M., Schneider, M. F. Alternating bipolar field stimulation identifies muscle fibers with defective excitability but maintained local Ca(2+) signals and contraction. Skeletal Muscle. 6, 6 (2016).
- Klein, M. G., Simon, B. J., Szucs, G., Schneider, M. F. Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high- and low-affinity calcium indicators. Biophysical Journal. 53 (6), 971-988 (1988).
- Irving, M., Maylie, J., Sizto, N. L., Chandler, W. K. Intrinsic optical and passive electrical properties of cut frog twitch fibers. The Journal of General Physiology. 89 (1), 1-40 (1987).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca(2+) release in adult skeletal muscle fibres. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 108 (3), 98-118 (2012).
- Banks, Q., et al. Optical recording of action potential initiation and propagation in mouse skeletal muscle fibers. Biophysical Journal. 115 (11), 2127-2140 (2018).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap II: more recent advances in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The Journal of Experimental Biology. 219, 175-182 (2016).
- Bannister, R. A., Beam, K. G. Ca(V)1.1: The atypical prototypical voltage-gated Ca2+ channel. Biochimica et Biophysica Acta. 1828 (7), 1587-1597 (2013).
- Beard, N. A., Wei, L., Dulhunty, A. F. Ca(2+) signaling in striated muscle: the elusive roles of triadin, junctin, and calsequestrin. European Biophysics Journal. 39 (1), 27-36 (2009).
- Polster, A., Perni, S., Bichraoui, H., Beam, K. G. Stac adaptor proteins regulate trafficking and function of muscle and neuronal L-type Ca2+ channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 602-606 (2015).
- Perni, S. The builders of the junction: roles of Junctophilin1 and Junctophilin2 in the assembly of the sarcoplasmic reticulum-plasma membrane junctions in striated muscle. Biomolecules. 12 (1), 109 (2022).
