Электрическое зондирование ячейки-подложки для оценки токсикологических профилей металлоорганического каркаса в режиме реального времени

Summary

В следующем исследовании оценивается токсикологический профиль выбранного металлоорганического каркаса с использованием датчика импеданса электрического элемента с субстратом (ECIS), высокопроизводительного метода скрининга в режиме реального времени.

Abstract

Металлоорганические каркасы (MOFs) представляют собой гибриды, образующиеся в результате координации ионов металлов и органических линкеров в органических растворителях. Внедрение MOFs в биомедицинские и промышленные приложения вызвало опасения по поводу их безопасности. В данной работе профиль выбранного MOF, цеолитового имидазолового каркаса, оценивался при воздействии эпителиальных клеток легких человека. Платформой для оценки послужил метод реального времени (т.е. измерение импеданса электрического элемента с подложкой [ECIS]). В этом исследовании выявлены и обсуждены некоторые из вредных эффектов выбранного MOF на подвергшиеся воздействию клетки. Кроме того, это исследование демонстрирует преимущества использования метода в реальном времени по сравнению с другими биохимическими анализами для комплексной оценки клеток. В исследовании сделан вывод о том, что наблюдаемые изменения в поведении клеток могут указывать на возможную токсичность, индуцированную воздействием MOFs с различными физико-химическими характеристиками и дозировкой используемых структур. Понимая изменения в поведении клеток, можно предвидеть возможность улучшения безопасных стратегий MOFs, которые будут использоваться в биомедицинских приложениях, путем специфической адаптации их физико-химических характеристик.

Introduction

Металлоорганические каркасы (МОФ) представляют собой гибриды, образующиеся в результате комбинации ионов металлов и органических линкеров ^1,2 в органических растворителях. Благодаря разнообразию таких комбинаций MOF обладают структурным разнообразием³, настраиваемой пористостью, высокой термической стабильностью и большой площадью поверхности ^4,5. Такие характеристики делают их привлекательными кандидатами в различных областях применения, от хранения газов^6,7 до катализа^8,9 и от контрастных веществ 10,11 до устройств доставки лекарств ^12,13. Тем не менее, внедрение MOF в такие приложения вызвало опасения по поводу их безопасности как для пользователей, так и для окружающей среды. Предварительные исследования показали, например, что клеточная функция и рост изменяются при воздействии на клетки ионов металлов или линкеров, используемых для синтеза MOF 1,14,15. Например, Tamames-Tabar et al. продемонстрировали, что ZIF-8 MOF, MOF на основе Zn, приводит к большему количеству клеточных изменений в клеточной линии рака шейки матки человека (HeLa) и клеточной линии макрофагов мыши (J774) по сравнению с MOFs на основе Zr и Fe. Такие эффекты, по-видимому, были обусловлены металлическим компонентом ZIF-8 (т.е. Zn), который потенциально мог индуцировать апоптоз клеток при распаде каркаса и высвобождении иона Zn¹. Аналогичным образом, Gandara-Loe et al. продемонстрировали, что HKUST-1, MOF на основе Cu, вызывает наибольшее снижение жизнеспособности клеток ретинобластомы мышей при использовании в концентрациях 10 мкг/мл или выше. По-видимому, это было связано с ионом металла Cu, включенным во время синтеза этого каркаса, который, будучи высвобожденным, мог индуцировать окислительный стресс в подвергшихся воздействию клетках¹⁵.

Более того, анализ показал, что воздействие MOFs с различными физико-химическими характеристиками может приводить к различным реакциям облученных клеток. Например, Wagner et al. продемонстрировали, что ZIF-8 и MIL-160 (каркас на основе Al), используемые при экспонировании иммортализированной эпителиальной клетки бронхов человека, приводят к клеточным реакциям, зависящим от физико-химических свойств каркасов, а именно гидрофобности, размера и структурных характеристик¹⁶. Кроме того, Chen et al. продемонстрировали, что концентрация 160 мкг/мл MIL-100(Fe) при воздействии на нормальные клетки печени человека (HL-7702) вызывает наибольшую потерю клеточной жизнеспособности, предположительно из-за металлического компонента этого специфического каркаса (т.е. Fe¹⁷).

Несмотря на то, что эти исследования классифицируют вредное воздействие MOFs на клеточные системы на основе их физико-химических характеристик и концентраций воздействия, что вызывает потенциальные опасения по поводу внедрения рамок, особенно в биомедицинских областях, большинство этих оценок основаны на колориметрическом анализе в одной временной точке. Например, было показано, что при использовании анализов (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) и водорастворимой соли тетразолия (WST-1) эти биохимические реагенты могут приводить к ложноположительным результатам при их взаимодействии с частицами, которым клетки также подвергались¹⁸. Показано, что соль тетразолия и нейтральные красные реагенты обладают высоким адсорбционным или связывающим сродством к поверхности частиц, что приводит к интерференции сигнала агента¹⁹. Более того, для других типов анализов, таких как проточная цитометрия, которая, как было показано ранее, используется для оценки изменений в клетках, подвергшихся воздействию^{MOFs 20,21}, было показано^, что основные проблемы должны быть обойдены, если мы хотим рассмотреть жизнеспособный анализ вредного воздействия частиц. В частности, необходимо учитывать диапазоны обнаружения размеров частиц, особенно в смешанных популяциях, таких как те, которые предлагаются MOFs или эталонами частиц, используемых для калибровки до клеточных^{изменений22}. Также было показано, что краситель, используемый во время мечения клеток для таких цитометрических анализов, может также взаимодействовать с наночастицами, воздействию которых подвергались^{клетки.}

Цель этого исследования состояла в том, чтобы использовать высокопроизводительный оценочный анализ в режиме реального времени для оценки изменений в поведении клеток при воздействии выбранного MOF. Оценки в режиме реального времени могут помочь получить представление об эффектах, зависящих от времени, связанных с окнами экспозиций¹⁶. Кроме того, они предоставляют информацию об изменениях в межклеточно-субстратных взаимодействиях, морфологии клеток и межклеточных взаимодействиях, а также о том, как такие изменения зависят от физико-химических свойств интересующих материалов и времени экспозиции^24,25 соответственно.

Для демонстрации валидности и применимости предложенного подхода использовали клетки бронхиального эпителия человека (BEAS-2B), ZIF-8 (гидрофобный каркас цеолитового имидазолата¹⁶) и зондирование импеданса электрических клеток-субстратов (ECIS). Клетки BEAS-2B представляют собой модель воздействия на легкие 26 и ранее использовались для оценки изменений при воздействии на клетки наноглин и их термически разлагаемых побочных продуктов^26,27,28, а также для оценки токсичности наноматериалов^, таких как одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ)¹⁸. Кроме того, такие клетки используются уже более 30 лет в качестве модели функции легочного эпителия²⁹. ZIF-8 был выбран из-за его широкого применения в катализе³⁰ и в качестве контрастных агентов³¹ для биовизуализации и доставки лекарств³² и, таким образом, из-за расширенного потенциала воздействия на легкие во время таких применений. Наконец, ECIS, неинвазивный метод в режиме реального времени, ранее использовался для оценки изменений в адгезии, пролиферации, подвижности и морфологии клеток в результате различных взаимодействий между аналитами (как материалами, так и лекарственными препаратами) и подвергшимися воздействию клетками^в режиме реального времени^16,18,28. ECIS использует переменный ток (AC) для измерения импеданса ячеек, иммобилизованных на золотых электродах, при этом изменения импеданса дают представление об изменениях сопротивления и емкости на границе раздела клетка-золотая подложка, барьерной функции, индуцированной межклеточными взаимодействиями, и покрытии таких золотых электродов надклеточным слоем^33,34. Использование ECIS позволяет проводить количественные измерения с наноразмерным разрешением неинвазивным способом в режиме реального времени^26,34.

В этом исследовании оценивается и сравнивается простота и легкость оценки индуцированных MOF изменений в клеточном поведении в режиме реального времени с одноточечными оценками анализа. Такое исследование может быть экстраполировано для оценки клеточных профилей в ответ на воздействие других частиц, представляющих интерес, что позволит провести безопасное тестирование частиц и последующее помощь в реализации. Кроме того, это исследование может дополнить генетические и клеточные анализы, которые представляют собой одноточечную оценку. Это может привести к более обоснованному анализу вредного воздействия частиц на клеточную популяцию и может быть использовано для скрининга токсичности таких частиц высокопроизводительным способом^16,35,36.

Protocol

1. Синтез ЗИФ-8 Для целей этого примера используйте массовое соотношение 1:10:100 (металл:линкер:растворитель) для синтеза ZIF-8. Для этого отмерьте гексагидрат нитрата цинка и запишите измерение. Используйте пример соотношения масс, чтобы рассчитать количество, необходимое для…

Representative Results

Используя обычную in vitro модельную клеточную линию39 (BEAS-2B), это исследование было направлено на то, чтобы продемонстрировать осуществимость и применимость ECIS для оценки изменений в поведении клеток при воздействии лабораторно синтезированного MOF. Оценка этих изменений…

Discussion

Предыдущий анализ показал, что ECIS может быть использован для оценки поведения клеток, подвергшихся воздействию аналитов (т.е. углеродных нанотрубок³⁵, лекарств⁴³ или наноглин¹⁶). Кроме того, Stueckle et al. использовали ECIS для оценки токсичности клеток BEAS-2B,…

Materials

4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)	Roche	5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25255-056
100 mm plates	Corning	430167
1300 Series A2 biofume hood	Thermo Scientific	323TS
2510 Branson bath sonicator	Process Equipment & Supply, Inc.	251OR-DTH
2-methylimidazole, 97%	Alfa Aesar	693-98-1
5 mL sterile microtube	Argos Technologies	T2076S-CA
50 mL  tubes	Falcon	352098
96W10idf well plates	Applied Biophysics	96W10idf PET
96-well plates	Fisherbrand	FB012931
Biorender	Biorender	N/A
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
Countess II FL automated cell counter	Life Technologies	C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater	Denton Vacuum	N/A
Dimethly sulfoxide	Corning	25-950-CQC
DPBS/Modified	Cytiva	SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium	Corning	10-014-CV
ECIS-ZΘ	Applied Biophysics	ABP 1129
Excel	Microsoft	Version 2301
Falcon tubes (15 mL)	Corning	352196
Fetal bovine serum	Gibco	16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader	BMG LABTECH	413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0)	GraphPad Software, LLC	Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray	Hitachi High-Technologies Corporation	S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells	American Type Culture Collection	CRL-9609
Isotemp freezer	Fisher Scientific
Methanol, 99%	Fisher Chemical	67-56-1
Parafilm sealing film	The Lab Depot	HS234526A
Penicillin/Steptomycin	Gibco	15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge	Thermo Scientific	75004220
Sorvall T 6000B	DU PONT	T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals, LLC	1691049
Vacuum Chamber	Belart	999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure	Acros Organic	101-96-18-9