Elektrische cel-substraatdetectie voor real-time evaluatie van toxicologische profielen van metaal-organische kaders

Summary

De volgende studie evalueert het toxicologische profiel van een geselecteerd metaal-organisch raamwerk met behulp van elektrische celsubstraatimpedantiedetectie (ECIS), een real-time, high-throughput screeningstechniek.

Abstract

Metaal-organische raamwerken (MOF’s) zijn hybriden die worden gevormd door de coördinatie van metaalionen en organische linkers in organische oplosmiddelen. De implementatie van MOFs in biomedische en industriële toepassingen heeft geleid tot bezorgdheid over hun veiligheid. Hierin werd het profiel van een geselecteerde MOF, een zeolitisch imidazolraamwerk, geëvalueerd bij blootstelling aan menselijke longepitheelcellen. Het platform voor evaluatie was een real-time techniek (d.w.z. elektrische cel-substraat impedantie sensing [ECIS]). Deze studie identificeert en bespreekt enkele van de schadelijke effecten van de geselecteerde MOF op de blootgestelde cellen. Bovendien toont deze studie de voordelen aan van het gebruik van de real-time methode ten opzichte van andere biochemische testen voor uitgebreide celevaluaties. De studie concludeert dat waargenomen veranderingen in celgedrag kunnen wijzen op mogelijke toxiciteit geïnduceerd bij blootstelling aan MOFs met verschillende fysisch-chemische kenmerken en de dosering van die kaders die worden gebruikt. Door veranderingen in celgedrag te begrijpen, voorziet men het vermogen om safe-by-design-strategieën van MOFs te verbeteren die worden gebruikt voor biomedische toepassingen door specifiek hun fysisch-chemische kenmerken aan te passen.

Introduction

Metaal-organische raamwerken (MOF’s) zijn hybriden gevormd door de combinatie van metaalionen en organische linkers ^1,2 in organische oplosmiddelen. Vanwege de verscheidenheid van dergelijke combinaties bezitten MOFs structurele diversiteit³, instelbare porositeit, hoge thermische stabiliteit en hoge oppervlakten ^4,5. Dergelijke kenmerken maken ze aantrekkelijke kandidaten in een verscheidenheid aan toepassingen, van gasopslag^6,7 tot katalyse^8,9, en van contrastmiddelen 10,11 tot medicijnafgifte-eenheden ^12,13. De implementatie van MOFs in dergelijke toepassingen heeft echter aanleiding gegeven tot bezorgdheid over hun veiligheid voor zowel de gebruikers als het milieu. Voorbereidende studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat cellulaire functie en groei veranderen bij de blootstelling van cellen aan metaalionen of linkers die worden gebruikt voor MOF-synthese 1,14,15. Tamames-Tabar et al. toonden bijvoorbeeld aan dat ZIF-8 MOF, een op Zn gebaseerde MOF, leidde tot meer cellulaire veranderingen in een menselijke baarmoederhalskankercellijn (HeLa) en een muismacrofaagcellijn (J774) ten opzichte van op Zr gebaseerde en Fe-gebaseerde MOFs. Dergelijke effecten waren vermoedelijk te wijten aan de metaalcomponent van ZIF-8 (d.w.z. Zn), die mogelijk celapoptose zou kunnen induceren bij raamwerkdesintegratie en Zn-ionenafgifte¹. Evenzo toonden Gandara-Loe et al. aan dat HKUST-1, een op Cu gebaseerde MOF, de hoogste vermindering van de levensvatbaarheid van muisretinoblastoomcellen veroorzaakte bij gebruik in concentraties van 10 μg / ml of meer. Dit was vermoedelijk te wijten aan het Cu-metaalion dat tijdens de synthese van dit raamwerk werd opgenomen en dat, eenmaal vrijgegeven, oxidatieve stress in de blootgestelde cellen kon induceren¹⁵.

Bovendien toonde analyse aan dat de blootstelling aan MOFs met verschillende fysisch-chemische kenmerken kon leiden tot verschillende reacties van blootgestelde cellen. Wagner et al. toonden bijvoorbeeld aan dat ZIF-8 en MIL-160 (een op Al gebaseerd raamwerk), gebruikt bij de blootstelling van een vereeuwigde menselijke bronchiale epitheelcel, leidden tot cellulaire reacties die afhankelijk waren van de fysisch-chemische eigenschappen van frameworks, namelijk hydrofobiciteit, grootte en structurele kenmerken¹⁶. Complementair toonden Chen et al. aan dat een concentratie van 160 μg / ml MIL-100 (Fe) blootgesteld aan menselijke normale levercellen (HL-7702) het grootste verlies aan cellulaire levensvatbaarheid veroorzaakte, vermoedelijk als gevolg van de metalen component van dit specifieke raamwerk (d.w.z. Fe¹⁷).

Hoewel deze studies de schadelijke effecten van MOFs op cellulaire systemen categoriseren op basis van hun fysisch-chemische kenmerken en blootstellingsconcentraties, waardoor potentiële zorgen ontstaan over de implementatie van het kader, vooral op biomedisch gebied, zijn de meeste van deze evaluaties gebaseerd op colorimetrische assays met één tijdspunt. Er werd bijvoorbeeld aangetoond dat wanneer (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) tetrazolium (MTT) en in water oplosbaar tetrazoliumzout (WST-1) assays werden gebruikt, deze biochemische reagentia konden leiden tot valse positieven bij hun interacties met de deeltjes waaraan de cellen ook werden blootgesteld¹⁸. Het tetrazoliumzout en de neutrale rode reagentia bleken een hoge adsorptie- of bindingsaffiniteit op de oppervlakken van de deeltjes te bezitten, wat resulteerde in signaalinterferentie van het middel¹⁹. Bovendien werd voor andere soorten testen, zoals flowcytometrie, waarvan eerder is aangetoond dat deze worden gebruikt voor het beoordelen van veranderingen in cellen die zijn blootgesteld aan MOFs^20,21, aangetoond dat belangrijke problemen moeten worden omzeild om een levensvatbare analyse van de schadelijke effecten van deeltjes te overwegen. In het bijzonder moeten detectiebereiken van de grootte van de deeltjes, vooral in gemengde populaties zoals die worden aangeboden door MOFs of referenties van de deeltjes die worden gebruikt voor kalibratie vóór cellulaire veranderingen, worden aangepakt²². Er werd ook aangetoond dat de kleurstof die wordt gebruikt tijdens celetikettering voor dergelijke cytometrietests ook kan interfereren met de nanodeeltjes waaraan de cellen werden blootgesteld²³.

Het doel van deze studie was om een real-time, high-throughput evaluatietest te gebruiken om veranderingen in celgedrag te beoordelen bij blootstelling aan een geselecteerde MOF. Real-time evaluaties kunnen helpen inzicht te geven in tijdsafhankelijke effecten, zoals gerelateerd aan de vensters van blootstellingen¹⁶. Verder geven ze informatie over veranderingen in cel-substraatinteracties, celmorfologie en cel-celinteracties, evenals hoe dergelijke veranderingen afhankelijk zijn van de fysisch-chemische eigenschappen van de materialen van belang en blootstellingstijden^24,25 respectievelijk.

Om de validiteit en toepasbaarheid van de voorgestelde aanpak aan te tonen, werden menselijke bronchiale epitheelcellen (BEAS-2B), ZIF-8 (een hydrofoob raamwerk van zeolitisch imidazolaat¹⁶) en elektrische celsubstraatimpedantiedetectie (ECIS) gebruikt. BEAS-2B-cellen vertegenwoordigen een model voor longblootstelling 26 en zijn eerder gebruikt om veranderingen te evalueren bij de blootstelling van cellen aan nanoclays en hun thermisch afgebroken bijproducten^26,27,28, evenals om de toxiciteit van nanomaterialen te beoordelen^, zoals enkelwandige koolstofnanobuizen (SWCNT’s)¹⁸. Bovendien worden dergelijke cellen al meer dan 30 jaar gebruikt als model voor de longepitheelfunctie²⁹. ZIF-8 werd gekozen vanwege de brede implementatie in katalyse³⁰ en als contrastmiddelen 31 voor bioimaging en medicijnafgifte³², en dus voor het uitgebreide potentieel voor longblootstelling tijdens dergelijke toepassingen. Ten slotte werd ECIS, de niet-invasieve, real-time techniek, eerder gebruikt om veranderingen in celtrouw, proliferatie, motiliteit en morfologie te evalueren 16,26 als gevolg van een verscheidenheid aan interacties tussen analyten (zowel materialen als geneesmiddelen) en blootgestelde cellen in realtime ^16,18,28. ECIS gebruikt een wisselstroom (AC) om de impedantie van cellen geïmmobiliseerd op gouden elektroden te meten, waarbij de impedantieveranderingen inzicht geven in veranderingen in weerstand en capaciteit op de cel-goudsubstraatinterface, barrièrefunctie zoals geïnduceerd door cel-celinteracties en over-cel laagdekking van dergelijke gouden elektroden^33,34. Het gebruik van ECIS maakt kwantitatieve metingen op nanoschaal mogelijk op een niet-invasieve, real-time manier^26,34.

Deze studie beoordeelt en vergelijkt de eenvoud en het gemak van evaluatie van MOF-geïnduceerde veranderingen in cellulair gedrag in real-time met single-point assay evaluaties. Een dergelijke studie zou verder kunnen worden geëxtrapoleerd voor het evalueren van celprofielen in reactie op blootstelling aan andere deeltjes van belang, waardoor veilige deeltjestests door ontwerp mogelijk worden gemaakt en vervolgens kunnen worden geholpen bij de implementatie. Bovendien zou deze studie een aanvulling kunnen zijn op genetische en cellulaire testen die single-point evaluaties zijn. Dit zou kunnen leiden tot een beter geïnformeerde analyse van de schadelijke effecten van deeltjes op de cellulaire populatie en zou kunnen worden gebruikt voor het screenen van de toxiciteit van dergelijke deeltjes op een manier^met een hoge doorvoer 16,35,36.

Protocol

1. ZIF-8 synthese Gebruik voor dit voorbeeld een massaverhouding van 1:10:100 (metaal:linker:oplosmiddel) om de ZIF-8 te synthetiseren. Meet hiervoor zinknitraathexahydraat en noteer de meting. Gebruik de voorbeeldmassaverhouding om de hoeveelheid te berekenen die nodig is voor de linker, 2-methylimidazol en het oplosmiddel (d.w.z. methanol). Plaats het zinknitraathexahydraat en de linker in twee verschillende glazen injectieflacons. Voeg de helft van de berekende hoeveelheid methanol…

Representative Results

Met behulp van een gemeenschappelijk in vitro model cellijn39 (BEAS-2B), was deze studie gericht op het aantonen van de haalbaarheid en toepasbaarheid van ECIS om veranderingen in celgedrag te beoordelen bij blootstelling aan een in het laboratorium gesynthetiseerde MOF. Deze beoordeling van veranderingen werd aangevuld met analyse door middel van conventionele colorimetrische assays. De fysisch-chemische kenmerken van het raamwerk werden eerst geëvalueerd om …

Discussion

Eerdere analyse toonde aan dat ECIS kan worden gebruikt om het gedrag te beoordelen van cellen die worden blootgesteld aan analyten (d.w.z. koolstofnanobuisjes³⁵, geneesmiddelen⁴³ of nanoklei¹⁶). Bovendien gebruikten Stueckle et al. ECIS om de toxiciteit van BEAS-2B-cellen blootgesteld aan nanoclays en hun bijproducten te evalueren en vonden dat het cellulaire gedrag en de hechting afhankelijk waren van de fysisch-chemische kenmerken van dergelijke m…

Materials

4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)	Roche	5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25255-056
100 mm plates	Corning	430167
1300 Series A2 biofume hood	Thermo Scientific	323TS
2510 Branson bath sonicator	Process Equipment & Supply, Inc.	251OR-DTH
2-methylimidazole, 97%	Alfa Aesar	693-98-1
5 mL sterile microtube	Argos Technologies	T2076S-CA
50 mL  tubes	Falcon	352098
96W10idf well plates	Applied Biophysics	96W10idf PET
96-well plates	Fisherbrand	FB012931
Biorender	Biorender	N/A
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
Countess II FL automated cell counter	Life Technologies	C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater	Denton Vacuum	N/A
Dimethly sulfoxide	Corning	25-950-CQC
DPBS/Modified	Cytiva	SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium	Corning	10-014-CV
ECIS-ZΘ	Applied Biophysics	ABP 1129
Excel	Microsoft	Version 2301
Falcon tubes (15 mL)	Corning	352196
Fetal bovine serum	Gibco	16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader	BMG LABTECH	413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0)	GraphPad Software, LLC	Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray	Hitachi High-Technologies Corporation	S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells	American Type Culture Collection	CRL-9609
Isotemp freezer	Fisher Scientific
Methanol, 99%	Fisher Chemical	67-56-1
Parafilm sealing film	The Lab Depot	HS234526A
Penicillin/Steptomycin	Gibco	15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge	Thermo Scientific	75004220
Sorvall T 6000B	DU PONT	T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals, LLC	1691049
Vacuum Chamber	Belart	999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure	Acros Organic	101-96-18-9