JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
발생학

Optogenetische remming van Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in combinatie met meting van epitheliale spanning in Drosophila-embryo's

Published: April 14, 2023
doi:
10.3791/65314
, ,
1Department of Biological Sciences,Dartmouth College, 2School of Life Sciences,Westlake University, 3Department of Molecular Biology,Princeton University

Summary

Actomyosine contractiliteit speelt een belangrijke rol in cel- en weefselmorfogenese. Het is echter een uitdaging om actomyosinecontractiliteit in vivo acuut te manipuleren. Dit protocol beschrijft een optogenetisch systeem dat snel Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in Drosophila-embryo’s remt, waardoor het onmiddellijke verlies van epitheliale spanning na de inactivatie van actomyosine in vivo wordt onthuld.

Abstract

Contractiele krachten gegenereerd door actine en niet-spiermyosine II (“actomyosine contractiliteit”) zijn van cruciaal belang voor morfologische veranderingen van cellen en weefsels op meerdere lengteschalen, zoals celdeling, celmigratie, epitheliale vouwing en vertakkende morfogenese. Een diepgaand begrip van de rol van actomyosinecontractiliteit in morfogenese vereist benaderingen die de snelle inactivatie van actomyosine mogelijk maken, wat moeilijk te bereiken is met conventionele genetische of farmacologische benaderingen. Het gepresenteerde protocol demonstreert het gebruik van een op CRY2-CIBN gebaseerd optogenetisch dimerisatiesysteem, Opto-Rho1DN, om actomyosinecontractiliteit in Drosophila-embryo’s te remmen met nauwkeurige temporele en ruimtelijke controles. In dit systeem wordt CRY2 gefuseerd met de dominante negatieve vorm van Rho1 (Rho1DN), terwijl CIBN is verankerd aan het plasmamembraan. Blauw licht-gemedieerde dimerisatie van CRY2 en CIBN resulteert in een snelle translocatie van Rho1DN van het cytoplasma naar het plasmamembraan, waar het actomyosine inactiveert door endogene Rho1 te remmen. Daarnaast presenteert dit artikel een gedetailleerd protocol voor het koppelen van Opto-Rho1DN-gemedieerde inactivatie van actomyosine met laserablatie om de rol van actomyosine te onderzoeken bij het genereren van epitheliale spanning tijdens Drosophila ventrale groefvorming. Dit protocol kan worden toegepast op vele andere morfologische processen waarbij actomyosinecontractiliteit in Drosophila-embryo’s betrokken is met minimale modificaties. Over het algemeen is dit optogenetische hulpmiddel een krachtige benadering om de functie van actomyosinecontractiliteit te ontleden bij het beheersen van weefselmechanica tijdens dynamische weefselremodellering.

Introduction

Actomyosinecontractiliteit, de contractiele kracht die wordt uitgeoefend door niet-spiermyosine II (hierna ‘myosine’) op het F-actinenetwerk, is een van de belangrijkste krachten bij het veranderen van de celvorm en het aansturen van morfogeneseop weefselniveau 1,2. De activering van actomyosinecontractiliteit op het apicale domein van de epitheelcellen resulteert bijvoorbeeld in apicale vernauwing, die een verscheidenheid aan morfogenetische processen vergemakkelijkt, waaronder epitheliale vouwing, celextrusie, delaminatie en wondgenezing 3,4,5,6,7 . De activering van myosine vereist fosforylering van de regulerende lichte keten. Deze modificatie verlicht de remmende conformatie van de myosinemoleculen, waardoor ze bipolaire myosinefilamentbundels kunnen vormen met meerdere hoofddomeinen aan beide uiteinden. De bipolaire myosinefilamenten drijven de anti-parallelle beweging van actinefilamenten aan en resulteren in het genereren van contractiele kracht 1,8,9.

De evolutionair geconserveerde Rho-familie kleine GTPase RhoA (Rho1 in Drosophila) speelt een centrale rol in de activering van actomyosinecontractiliteit in verschillende cellulaire contexten10,11. Rho1 functioneert als een bimoleculaire switch door gtp (actieve vorm) of bbp (inactieve vorm)12 te binden. De cyclus tussen GTP- of GDP-gebonden Rho1 wordt gereguleerd door zijn GTPase-activerende eiwitten (GAPs) en guanine-nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEF’s)13. GEF’s functioneren om de uitwisseling van BBP voor GTP te vergemakkelijken en zo Rho1-activiteit te activeren. GAPs daarentegen verbeteren de GTPase-activiteit van Rho1 en deactiveren zo Rho1. Geactiveerd Rho1 bevordert actomyosine contractiliteit door interactie met en activering van de downstream effectoren, Rho-geassocieerde kinase (Rok) en Diaphanous14. Rok induceert myosine-activering en actomyosinecontractiliteit door fosforylering van de regulerende lichte keten van myosine15. Daarnaast remt Rok ook de myosineregulerende lichte ketenfosfatase, en bevordert zo de myosinefilamentassemblageverder 16. Rok kan ook LIM-kinasen fosforyleren, die, wanneer geactiveerd, actinedemontage voorkomen door de actine-depolymerisatiefactor cofiline17,18 te fosforyleren en te remmen. Doorschijnend is een formine familie actine nucleator die actine polymerisatie bevordert, het verstrekken van een basis voor myosine te interageren met 19,20,21.

Hoewel de cellulaire mechanismen die actomyosinecontractiliteit activeren goed zijn opgehelderd, blijft ons begrip van de functie ervan bij het reguleren van dynamische weefselremodellering onvolledig. Het opvullen van deze kenniskloof vereist benaderingen die actomyosine snel kunnen inactiveren bij specifieke weefselregio’s in vivo en de onmiddellijke impact op weefselgedrag en -eigenschappen kunnen registreren. Dit protocol beschrijft het gebruik van een optogenetische benadering om actomyosinecontractiliteit acuut te remmen tijdens Drosophila mesoderm invaginatie, gevolgd door meting van epitheliale spanning met behulp van laserablatie. Tijdens Drosophila gastrulatie ondergaan de ventraal gelokaliseerde mesoderm-voorlopercellen apicale vernauwing en invaginaleren van het oppervlak van het embryo door een voorste-posterieur georiënteerde groefte vormen 22,23. De vorming van ventrale groeven wordt al lang gebruikt als model voor het bestuderen van het mechanisme van epitheliale vouwing. Ventrale groefvorming wordt toegediend door het dorsaal-ventrale patroonsysteem in Drosophila24,25,26,27. De expressie van twee transcriptiefactoren, Twist en Snail, gelegen aan de ventrale zijde van het embryo, regelt de ventrale groefvorming en specificeert het lot van mesodermale cellen28. Twist en Snail activeren de rekrutering van de Rho1 GEF RhoGEF2 naar de top van de mesodermvoorlopercellen via een G-eiwit gekoppelde receptorroute en een RhoGEF2-adaptoreiwit, T48 29,30,31,32,33. Vervolgens activeert RhoGEF2 myosine in het apicale oppervlak van het potentiële mesoderm via de Rho-Rho-kinaseroute 34,35,36,37,38,39. Geactiveerd myosine vormt een supracellulair actomyosinenetwerk door het apicale oppervlak van het mesoderm primordium, waarvan de samentrekkingen apicale vernauwing veroorzaken en resulteren in een snelle toename van de apicale weefselspanning 14,37,40.

De optogenetische tool beschreven in dit protocol, Opto-Rho1DN, remt actomyosine contractiliteit door blauw-licht afhankelijke plasmamembraan rekrutering van een dominante negatieve vorm van Rho1 (Rho1DN)41. Een T19N-mutatie in Rho1DN elimineert het vermogen van het gemuteerde eiwit om GDP in te ruilen voor GTP en maakt het eiwit dus voortdurend inactief34. Een volgende mutatie in Rho1DN, C189Y, elimineert het naïeve membraanrichtsignaal42,43. Wanneer Rho1DN wordt toegediend aan het plasmamembraan, bindt het zich aan Rho1 GEF’s en neemt het het vast, waardoor de activering van Rho1 en Rho1-gemedieerde activering van myosine en actine34,44 wordt geblokkeerd. De plasmamembraanrekrutering van Rho1DN wordt bereikt door een lichtafhankelijke dimerisatiemodule afgeleid van Cryptochrome 2 en zijn bindingspartner CIB1. Cryptochrome 2 is een blauwlicht geactiveerde Cryptochrome fotoreceptor in Arabidopsis thaliana45. Cryptochroom 2 bindt aan CIB1, een basisch helix-loop-helix-eiwit, alleen in zijn foto-geëxciteerde toestand45. Later bleek dat het geconserveerde N-terminale, fotolyase homologiegebied (PHR), van Cryptochrome 2 (CRY2PHR, hierna CRY2 genoemd) en het N-terminale domein (aa 1-170) van CIB1 (hierna CIBN) belangrijk zijn voor lichtgeïnduceerde dimerisatie46. Opto-Rho1DN bevat twee componenten. De eerste component is het CIBN-eiwit gefuseerd met een CAAX-anker, dat het eiwit lokaliseert naar het plasmamembraan47. De tweede component is mCherry-tagged CRY2 gefuseerd met Rho1DN41. Bij afwezigheid van blauw licht blijft CRY2-Rho1DN in het cytoplasma. Bij stimulatie van blauw licht wordt CRY2-Rho1DN gericht op het plasmamembraan door de interactie tussen membraanverankerde CIBN en geëxciteerde CRY2. Opto-Rho1DN kan worden geactiveerd door ultraviolet A (UVA) licht en blauw licht (400-500 nm, piekactivering bij 450-488 nm), of door een 830-980 nm gepulseerde laser bij het uitvoeren van twee-foton stimulatie41,46,47,48. Daarom wordt Opto-Rho1DN gestimuleerd door golflengten die normaal worden gebruikt voor opwindende GFP (488 nm voor beeldvorming met één foton en 920 nm voor beeldvorming met twee fotonen). Daarentegen stimuleren golflengten die gewoonlijk worden gebruikt voor opwindende mCherry (561 nm voor beeldvorming met één foton en 1.040 nm voor beeldvorming met twee fotonen) de optogenetische module niet en kunnen daarom worden gebruikt voor pre-stimulatiebeeldvorming. Het protocol beschrijft de benaderingen die worden gebruikt om het risico op ongewenste stimulatie tijdens monstermanipulatie te minimaliseren.

Laserablatie is op grote schaal gebruikt om spanning in cellen en weefsels te detecteren en te meten49. Eerdere studies hebben aangetoond dat, wanneer de laserintensiteit op de juiste manier wordt gecontroleerd, twee-foton laserablatie met behulp van een femtoseconde nabij-infrarode laser sommige subcellulaire structuren (bijv. Corticale actomyosinenetwerken) fysiek kan aantasten zonder plasmamembraanopname50,51 te veroorzaken. Als het weefsel onder spanning staat, resulteert laserablatie van een interessant gebied in het weefsel in een onmiddellijke uitwendige terugslag van de cellen naast het geableerde gebied. De terugslagsnelheid is een functie van de grootte van de spanning en de viscositeit van de media (cytoplasma) rond de structuren die terugslag ondergaan49. Vanwege de superieure penetratiediepte van de nabij-infrarode lasers en het vermogen om goed begrensde focale ablatie te bereiken, is twee-foton laserablatie bijzonder nuttig voor het detecteren van weefselspanning in vivo. Zoals aangetoond in dit protocol, kan deze methode gemakkelijk worden gecombineerd met Opto-Rho1DN-gemedieerde inactivatie van actomyosinecontractiliteit om de directe impact van Rho1-afhankelijke cellulaire contractiliteit op weefselmechanica tijdens dynamische weefselremodellering te onderzoeken.

Protocol

1. Het instellen van het genetische kruis en het voorbereiden van de eicelverzamelbeker Selecteer vrouwelijke vliegen (maagd) uit de optogenetische lijn UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) op een CO2-pad onder een stereomicroscoop en zet een kruising op met mannelijke vliegen van de moederlijke GAL4-driverlijn 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherine-GFP.OPMERKING: De 67 en 15 staan voor maternale-Tubuline-GAL4 ingebracht in de tweede (II) en derde (III) chromosomen, respectiev…

Representative Results

In de niet-gestimuleerde embryo’s die apicale vernauwing ondergingen, werd Sqh-mCherry verrijkt in het medioapische gebied van de ventrale mesodermale cellen, terwijl CRY2-Rho1DN-mCherry cytosolisch was (figuur 1A). Laserablatie binnen het vernauwingsdomein leidde tot een snelle weefselterugslag langs de A-P-as (figuur 1B,C). In de gestimuleerde embryo’s werd het CRY2-Rho1DN-mCherry-signaal plasmamembraan gelokaliseerd, terwijl het medioapische …

Discussion

Dit protocol beschreef het gecombineerde gebruik van optogenetica en laserablatie om veranderingen in weefselspanning onmiddellijk na de inactivatie van actomyosinecontractiliteit te onderzoeken. De hier beschreven optogenetische tool maakt gebruik van de dominante negatieve vorm van Rho1 (Rho1DN) om endogene Rho1- en Rho1-afhankelijke actomyosinecontractiliteit acuut te remmen. Eerdere karakterisering van Opto-Rho1DN in de context van Drosophila ventrale groefvorming toonde aan dat de tool zeer effectief is in …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Ann Lavanway voor de ondersteuning van beeldvorming. De auteurs bedanken het Wieschaus-lab en het De Renzis-lab voor het delen van reagentia en het Bloomington Drosophila Stock Center voor vliegenvoorraden. Deze studie wordt ondersteund door NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 en American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 aan BH.

Materials

35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. 발생학. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. 유전학. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -. A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -. M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Tags

OptogeneticsActomyosin ContractilityEpithelial TensionDrosophila EmbryosLaser AblationMechanical ForcesCell MechanicsCell Sheet FoldingApical Constriction
check_url/kr/65314?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image