Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen

Summary

Die Kontraktilität von Actomyosin spielt eine wichtige Rolle bei der Zell- und Gewebemorphogenese. Es ist jedoch schwierig, die Actomyosin-Kontraktilität in vivo akut zu manipulieren. Dieses Protokoll beschreibt ein optogenetisches System, das die Rho1-vermittelte Actomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen schnell hemmt und den sofortigen Verlust der Epithelspannung nach der Inaktivierung von Actomyosin in vivo aufdeckt.

Abstract

Kontraktile Kräfte, die durch Aktin und Nicht-Muskelmyosin II erzeugt werden (“Actomyosin-Kontraktilität”), sind entscheidend für morphologische Veränderungen von Zellen und Geweben auf mehreren Längenskalen, wie z. B. Zellteilung, Zellmigration, Epithelfaltung und verzweigte Morphogenese. Ein tiefgreifendes Verständnis der Rolle der Aktomyosin-Kontraktilität in der Morphogenese erfordert Ansätze, die eine schnelle Inaktivierung von Actomyosin ermöglichen, die mit herkömmlichen genetischen oder pharmakologischen Ansätzen nur schwer zu erreichen ist. Das vorgestellte Protokoll demonstriert die Verwendung eines CRY2-CIBN-basierten optogenetischen Dimerisierungssystems, Opto-Rho1DN, zur Hemmung der Aktomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen mit präzisen zeitlichen und räumlichen Kontrollen. In diesem System ist CRY2 mit der dominanten negativen Form von Rho1 (Rho1DN) fusioniert, während CIBN an der Plasmamembran verankert ist. Die Blaulicht-vermittelte Dimerisierung von CRY2 und CIBN führt zu einer schnellen Translokation von Rho1DN aus dem Zytoplasma in die Plasmamembran, wo es Actomyosin durch Hemmung von endogenem Rho1 inaktiviert. Darüber hinaus wird in diesem Artikel ein detailliertes Protokoll für die Kopplung der Opto-Rho1DN-vermittelten Inaktivierung von Aktomyosin mit der Laserablation vorgestellt, um die Rolle von Actomyosin bei der Erzeugung von Epithelspannung während der ventralen Furchenbildung von Drosophila zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auf viele andere morphologische Prozesse angewendet werden, die die Aktomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen mit minimalen Modifikationen beinhalten. Insgesamt ist dieses optogenetische Werkzeug ein leistungsfähiger Ansatz, um die Funktion der Actomyosin-Kontraktilität bei der Kontrolle der Gewebemechanik während des dynamischen Gewebeumbaus zu untersuchen.

Introduction

Die Actomyosin-Kontraktilität, die kontraktile Kraft, die von Nicht-Muskel-Myosin II (im Folgenden “Myosin”) auf das F-Aktin-Netzwerk ausgeübt wird, ist eine der wichtigsten Kräfte bei der Veränderung der Zellform und der Steuerung der Morphogenese auf Gewebeebene ^1,2. Zum Beispiel führt die Aktivierung der Actomyosin-Kontraktilität an der apikalen Domäne der Epithelzellen zu einer apikalen Verengung, die eine Vielzahl morphogenetischer Prozesse erleichtert, darunter Epithelfaltung, Zellextrusion, Delamination und Wundheilung 3,4,5,6,7 . Die Aktivierung von Myosin erfordert die Phosphorylierung seiner regulatorischen Leichtkette. Diese Modifikation mildert die hemmende Konformation der Myosinmoleküle, so dass sie bipolare Myosinfilamentbündel mit mehreren Kopfdomänen an beiden Enden bilden können. Die bipolaren Myosinfilamente treiben die antiparallele Bewegung der Aktinfilamente an und führen zur Erzeugung der Kontraktionskraft ^1,8,9.

Die evolutionär konservierte kleine GTPase RhoA (Rho1 in Drosophila) spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung der Aktomyosin-Kontraktilität in verschiedenen zellulären Kontexten^10,11. Rho1 fungiert als bimolekularer Schalter, indem es entweder GTP (aktive Form) oder GDP (inaktive Form) ^bindet12. Der Kreislauf zwischen GTP- oder GDP-gebundenem Rho1 wird durch seine GTPase-aktivierenden Proteine (GAPs) und Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) ^reguliert13. GEFs erleichtern den Austausch von BIP gegen GTP und aktivieren so die Rho1-Aktivität. GAPs hingegen verstärken die GTPase-Aktivität von Rho1 und deaktivieren so Rho1. Aktiviertes Rho1 fördert die Kontraktilität von Aktomyosin, indem es mit seinen nachgeschalteten Effektoren, der Rho-assoziierten Kinase (Rok) und Diaphanous¹⁴, interagiert und diese aktiviert. Rok induziert die Myosinaktivierung und die Aktomyosinkontraktilität durch Phosphorylierung der regulatorischen leichten Kette von Myosin¹⁵. Darüber hinaus hemmt Rok auch die Myosin-regulatorische Leichtkettenphosphatase und fördert somit die Myosin-Filament-Assemblierung¹⁶ weiter. Rok kann auch LIM-Kinasen phosphorylieren, die, wenn sie aktiviert werden, den Aktinabbau verhindern, indem sie den Aktin-Depolymerisationsfaktor Cofilin^17,18 phosphorylieren und hemmen. Diaphanous ist ein Aktinnukleator der Forminfamilie, der die Aktinpolymerisation fördert und eine Basis für die Interaktion von Myosin mit 19,20,21 bietet.

Während die zellulären Mechanismen, die die Kontraktilität von Actomyosin aktivieren, gut aufgeklärt sind, ist unser Verständnis seiner Funktion bei der Regulierung des dynamischen Gewebeumbaus noch unvollständig. Um diese Wissenslücke zu schließen, sind Ansätze erforderlich, die Actomyosin an bestimmten Geweberegionen in vivo schnell inaktivieren und die unmittelbaren Auswirkungen auf das Verhalten und die Eigenschaften des Gewebes aufzeichnen können. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur akuten Hemmung der Aktomyosin-Kontraktilität während der Einstülpung des Drosophila-Mesoderms, gefolgt von der Messung der Epithelspannung mittels Laserablation. Während der Gastrulation von Drosophila erleiden die ventral lokalisierten Mesoderm-Vorläuferzellen eine apikale Verengung und invaginatieren von der Oberfläche des Embryos, indem sie eine anterior-posterior orientierte Furche bilden^22,23. Die Bildung ventraler Furchen dient seit langem als Modell für die Untersuchung des Mechanismus der Epithelfaltung. Die Bildung der ventralen Furchen wird durch das dorsal-ventrale Mustersystem in Drosophila 24,25,26,27 gesteuert. Die Expression von zwei Transkriptionsfaktoren, Twist und Snail, die sich auf der ventralen Seite des Embryos befinden, steuert die ventrale Furchenbildung und spezifiziert das Schicksal der mesodermalen Zellen²⁸. Twist und Snail aktivieren die Rekrutierung des Rho1 GEF RhoGEF2 an die Spitze der Mesoderm-Vorläuferzellen über einen G-Protein-gekoppelten Rezeptorweg und ein RhoGEF2-Adapterprotein, T48 29,30,31,32,33. Als nächstes aktiviert RhoGEF2 Myosin auf der gesamten apikalen Oberfläche des potenziellen Mesoderms über den Rho-Rho-Kinase-Signalweg 34,35,36,37,38,39. Aktiviertes Myosin bildet ein suprazelluläres Actomyosin-Netzwerk auf der gesamten apikalen Oberfläche des Mesoderm-Primordiums, dessen Kontraktionen die apikale Verengung vorantreiben und zu einem schnellen Anstieg der apikalen Gewebespannung führen 14,37,40.

Das in diesem Protokoll beschriebene optogenetische Werkzeug, Opto-Rho1DN, hemmt die Kontraktilität von Actomyosin durch Blaulicht-abhängige Plasmamembranrekrutierung einer dominanten negativen Form von Rho1 (Rho1DN)⁴¹. Eine T19N-Mutation in Rho1DN eliminiert die Fähigkeit des mutierten Proteins, GDP gegen GTP auszutauschen, und macht das Protein somit dauerhaft inaktiv³⁴. Eine nachfolgende Mutation in Rho1DN, C189Y, eliminiert dessen naives Membran-Targeting-Signal^42,43. Wenn Rho1DN in die Plasmamembran infundiert wird, bindet es an Rho1-GEFs und staut sie, wodurch die Aktivierung von Rho1 sowie die Rho1-vermittelte Aktivierung von Myosin und Aktin blockiert^{werden 34,44}. Die Rekrutierung von Rho1DN in der Plasmamembran erfolgt durch ein lichtabhängiges Dimerisierungsmodul, das von Cryptochrom 2 und seinem Bindungspartner CIB1 abgeleitet ist. Cryptochrom 2 ist ein durch blaues Licht aktivierter Cryptochrom-Photorezeptor in Arabidopsis thaliana⁴⁵. Cryptochrom 2 bindet nur im photoangeregten Zustand an CIB1, ein basisches Helix-Schleifen-Helix-Protein⁴⁵. Später wurde festgestellt, dass die konservierte N-terminale Photolyase-Homologie-Region (PHR) von Cryptochrom 2 (CRY2_PHR, im Folgenden als CRY2 bezeichnet) und die N-terminale Domäne (aa 1-170) von CIB1 (im Folgenden CIBN) für die lichtinduzierte Dimerisierung wichtig sind⁴⁶. Opto-Rho1DN besteht aus zwei Komponenten. Die erste Komponente ist das CIBN-Protein, das mit einem CAAX-Anker fusioniert ist, der das Protein an der Plasmamembran⁴⁷ lokalisiert. Die zweite Komponente ist mCherry-markiertes CRY2, das mit Rho1DN⁴¹ fusioniert ist. In Abwesenheit von blauem Licht verbleibt CRY2-Rho1DN im Zytoplasma. Nach Stimulation durch blaues Licht wird CRY2-Rho1DN durch die Wechselwirkung zwischen membranverankertem CIBN und angeregtem CRY2 auf die Plasmamembran gerichtet. Opto-Rho1DN kann durch ultraviolettes A-Licht (UVA) und blaues Licht (400-500 nm, maximale Aktivierung bei 450-488 nm) oder durch einen gepulsten Laser mit 830-980 nm aktiviert werden, wenn eine Zwei-Photonen-Stimulation durchgeführt^{wird 41,46,47,48}. Daher wird Opto-Rho1DN durch Wellenlängen stimuliert, die normalerweise für die Anregung von GFP verwendet werden (488 nm für die Einzelphotonen-Bildgebung und 920 nm für die Zwei-Photonen-Bildgebung). Im Gegensatz dazu stimulieren Wellenlängen, die üblicherweise für die Anregung von mCherry verwendet werden (561 nm für die Einzelphotonen-Bildgebung und 1.040 nm für die Zwei-Photonen-Bildgebung), das optogenetische Modul nicht und können daher für die Bildgebung vor der Stimulation verwendet werden. Das Protokoll beschreibt die Ansätze, die verwendet werden, um das Risiko einer unerwünschten Stimulation während der Probenmanipulation zu minimieren.

Die Laserablation wurde in großem Umfang eingesetzt, um Spannungen in Zellen und Geweben zu erkennen und zu messen⁴⁹. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Zwei-Photonen-Laserablation unter Verwendung eines Femtosekunden-Nahinfrarotlasers bei entsprechender Kontrolle der Laserintensität einige subzelluläre Strukturen (z. B. kortikale Actomyosin-Netzwerke) physikalisch beeinträchtigen kann, ohne eine Plasmamembran-Raptur zu verursachen^50,51. Wenn das Gewebe unter Spannung steht, führt die Laserablation einer interessierenden Region innerhalb des Gewebes zu einem sofortigen Rückstoß der an die abgetragene Region angrenzenden Zellen nach außen. Die Rückstoßgeschwindigkeit ist eine Funktion der Größe der Spannung und der Viskosität des Mediums (Zytoplasma), das die Strukturen umgibt, die dem Rückstoß ausgesetzt sind⁴⁹. Aufgrund der überlegenen Eindringtiefe der Nahinfrarotlaser und der Möglichkeit, eine gut begrenzte fokale Ablation zu erreichen, ist die Zwei-Photonen-Laserablation besonders nützlich für die Erkennung von Gewebespannungen in vivo. Wie in diesem Protokoll gezeigt, kann diese Methode leicht mit der Opto-Rho1DN-vermittelten Inaktivierung der Actomyosin-Kontraktilität kombiniert werden, um den direkten Einfluss der Rho1-abhängigen zellulären Kontraktilität auf die Gewebemechanik während des dynamischen Gewebeumbaus zu untersuchen.

Protocol

1. Aufstellen der genetischen Kreuzung und Vorbereiten des Eizellentnahmebechers Ausgewählte weibliche Fliegen (jungfräulich) aus der optogenetischen Linie UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) auf einem CO2 -Pad unter einem Stereomikroskop und eine Kreuzung mit männlichen Fliegen aus der mütterlichen GAL4-Treiberlinie 67 Sqh-mCherry; 15 E-Cadherin-GFP.ANMERKUNG: Die 67 und 15 stehen für maternales Tubulin-GAL4, das in das zweite (II) bzw. dritte (III) Chromosom ei…

Representative Results

In den nicht stimulierten Embryonen, die einer apikalen Konstriktion unterzogen wurden, wurde Sqh-mCherry in der medioapikalen Region der ventralen mesodermalen Zellen angereichert, während CRY2-Rho1DN-mCherry zytosolisch war (Abbildung 1A). Die Laserablation innerhalb der Verengungsdomäne führte zu einem raschen Geweberückstoß entlang der A-P-Achse (Abbildung 1B,C). In den stimulierten Embryonen wurde das CRY2-Rho1DN-mCherry-Signal in der …

Discussion

Dieses Protokoll beschrieb den kombinierten Einsatz von Optogenetik und Laserablation, um Veränderungen der Gewebespannung unmittelbar nach der Inaktivierung der Aktomyosin-Kontraktilität zu untersuchen. Das hier beschriebene optogenetische Werkzeug nutzt die dominante negative Form von Rho1 (Rho1DN), um die endogene Rho1- und Rho1-abhängige Actomyosin-Kontraktilität akut zu hemmen. Die vorherige Charakterisierung von Opto-Rho1DN im Zusammenhang mit der ventralen Furchenbildung von Drosophila zeigte, dass da…

Materials

35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation