Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila

Summary

La contrattilità dell’actomiosina svolge un ruolo importante nella morfogenesi cellulare e tissutale. Tuttavia, è difficile manipolare la contrattilità dell’actomiosina in vivo in modo acuto. Questo protocollo descrive un sistema optogenetico che inibisce rapidamente la contrattilità dell’actomiosina mediata da Rho1 negli embrioni di Drosophila , rivelando l’immediata perdita di tensione epiteliale dopo l’inattivazione dell’actomiosina in vivo.

Abstract

Le forze contrattili generate dall’actina e dalla miosina II non muscolare (“contrattilità dell’actomiosina”) sono fondamentali per i cambiamenti morfologici di cellule e tessuti su più scale di lunghezza, come la divisione cellulare, la migrazione cellulare, il ripiegamento epiteliale e la morfogenesi ramificata. Una comprensione approfondita del ruolo della contrattilità dell’actomiosina nella morfogenesi richiede approcci che consentano la rapida inattivazione dell’actomiosina, che è difficile da ottenere utilizzando approcci genetici o farmacologici convenzionali. Il protocollo presentato dimostra l’uso di un sistema di dimerizzazione optogenetica basato su CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, per inibire la contrattilità dell’actomiosina negli embrioni di Drosophila con precisi controlli temporali e spaziali. In questo sistema, CRY2 è fuso con la forma negativa dominante di Rho1 (Rho1DN), mentre CIBN è ancorato alla membrana plasmatica. La dimerizzazione mediata dalla luce blu di CRY2 e CIBN provoca una rapida traslocazione di Rho1DN dal citoplasma alla membrana plasmatica, dove inattiva l’actomiosina inibendo Rho1 endogeno. Inoltre, questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l’accoppiamento dell’inattivazione dell’actomiosina mediata da Opto-Rho1DN con l’ablazione laser per studiare il ruolo dell’actomiosina nella generazione di tensione epiteliale durante la formazione del solco ventrale di Drosophila . Questo protocollo può essere applicato a molti altri processi morfologici che coinvolgono la contrattilità dell’actomiosina negli embrioni di Drosophila con modifiche minime. Nel complesso, questo strumento optogenetico è un potente approccio per analizzare la funzione della contrattilità dell’actomiosina nel controllo della meccanica tissutale durante il rimodellamento dinamico dei tessuti.

Introduction

La contrattilità dell’actomiosina, la forza contrattile esercitata dalla miosina II non muscolare (di seguito «miosina») sulla rete di F-actina, è una delle forze più importanti nel modificare la forma delle cellule e nel guidare la morfogenesi a livello tissutale ^1,2. Ad esempio, l’attivazione della contrattilità dell’actomiosina nel dominio apicale delle cellule epiteliali provoca una costrizione apicale, che facilita una varietà di processi morfogenetici, tra cui il ripiegamento epiteliale, l’estrusione cellulare, la delaminazione e la guarigione delle ferite 3,4,5,6,7 . L’attivazione della miosina richiede la fosforilazione della sua catena leggera regolatrice. Questa modifica allevia la conformazione inibitoria delle molecole di miosina, consentendo loro di formare fasci di filamenti di miosina bipolari con più domini di testa su entrambe le estremità. I filamenti bipolari di miosina guidano il movimento antiparallelo dei filamenti di actina e provocano la generazione della forza contrattile ^1,8,9.

La piccola GTPasi RhoA della famiglia Rho, evolutivamente conservata, svolge un ruolo centrale nell’attivazione della contrattilità dell’actomiosina in vari contesti cellulari ^10,11. Rho1 funziona come un interruttore bimolecolare legando GTP (forma attiva) o GDP (forma inattiva)¹². Il ciclo tra Rho1 legato al GTP o al GDP è regolato dalle sue proteine attivanti la GTPasi (GAP) e dai fattori di scambio dei nucleotidi guanina (GEF)¹³. I GEF hanno la funzione di facilitare lo scambio di PIL con GTP e quindi di attivare l’attività di Rho1. I GAP, d’altra parte, potenziano l’attività GTPasica di Rho1 e quindi disattivano Rho1. Rho1 attivato promuove la contrattilità dell’actomiosina attraverso l’interazione e l’attivazione dei suoi effettori a valle, la chinasi associata a Rho (Rok) e la Diafana¹⁴. Rok induce l’attivazione della miosina e la contrattilità dell’actomiosina fosforilando la catena leggera regolatoria della miosina¹⁵. Inoltre, Rok inibisce anche la fosfatasi a catena leggera regolatrice della miosina e quindi promuove ulteriormente l’assemblaggio del filamento di miosina¹⁶. Rok può anche fosforilare le chinasi LIM che, una volta attivate, impediscono il disassemblaggio dell’actina fosforilando e inibendo il fattore di depolimerizzazione dell’actina cofilina^17,18. Diaphanous è un nucleatore di actina della famiglia delle formine che promuove la polimerizzazione dell’actina, fornendo una base per l’interazione della miosina con 19,20,21.

Mentre i meccanismi cellulari che attivano la contrattilità dell’actomiosina sono stati ben chiariti, la nostra comprensione della sua funzione nella regolazione del rimodellamento dinamico dei tessuti rimane incompleta. Per colmare questa lacuna di conoscenze sono necessari approcci in grado di inattivare rapidamente l’actomiosina in specifiche regioni tissutali in vivo e di registrare l’impatto immediato sul comportamento e sulle proprietà dei tessuti. Questo protocollo descrive l’uso di un approccio optogenetico per inibire in modo acuto la contrattilità dell’actomiosina durante l’invaginazione del mesoderma di Drosophila, seguito dalla misurazione della tensione epiteliale mediante ablazione laser. Durante la gastrulazione di Drosophila, le cellule precursori del mesoderma localizzate ventralmente subiscono una costrizione apicale e si invaginano dalla superficie dell’embrione formando un solco orientato antero-posteriormente^22,23. La formazione di solchi ventrali è stata a lungo utilizzata come modello per studiare il meccanismo del ripiegamento epiteliale. La formazione di solchi ventrali è amministrata dal sistema di pattern dorso-ventrale in Drosophila^24,25,26,27. L’espressione di due fattori di trascrizione, Twist e Snail, situati sul lato ventrale dell’embrione, controlla la formazione del solco ventrale e specifica il destino delle cellule mesodermiche²⁸. Twist e Snail attivano il reclutamento di Rho1 GEF RhoGEF2 all’apice delle cellule precursori del mesoderma attraverso una via recettoriale accoppiata a proteina G e una proteina adattatrice RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. Successivamente, RhoGEF2 attiva la miosina in tutta la superficie apicale del potenziale mesoderma attraverso la via chinasica Rho-Rho ^{34,35,36,37,38,39}. La miosina attivata forma una rete di actomiosina supracellulare in tutta la superficie apicale del mesoderma primordiale, le cui contrazioni guidano la costrizione apicale e provocano un rapido aumento della tensione del tessuto apicale 14,37,40.

Lo strumento optogenetico descritto in questo protocollo, Opto-Rho1DN, inibisce la contrattilità dell’actomiosina attraverso il reclutamento sulla membrana plasmatica dipendente dalla luce blu di una forma dominante negativa di Rho1 (Rho1DN)⁴¹. Una mutazione T19N in Rho1DN elimina la capacità della proteina mutante di scambiare il GDP con il GTP e quindi rende la proteina perennemente inattiva³⁴. Una successiva mutazione in Rho1DN, C189Y, elimina il suo naive segnale di targeting^{di membrana 42,43}. Quando Rho1DN viene infuso nella membrana plasmatica, si lega e trattiene i GEF di Rho1, bloccando così l’attivazione di Rho1 e l’attivazione mediata da Rho1 della miosina e dell’actina^34,44. Il reclutamento di Rho1DN sulla membrana plasmatica è ottenuto attraverso un modulo di dimerizzazione dipendente dalla luce derivato dal Criptocromo 2 e dal suo partner di legame CIB1. Il criptocromo 2 è un fotorecettore del criptocromo attivato dalla luce blu in Arabidopsis thaliana⁴⁵. Il criptocromo 2 si lega a CIB1, una proteina basica elica-loop-elica, solo nel suo stato fotoeccitato⁴⁵. In seguito si è scoperto che la regione di omologia della fotoliasi N-terminale conservata (PHR), dal criptocromo 2 (CRY2_PHR, di seguito denominato CRY2) e il dominio N-terminale (aa 1-170) di CIB1 (da qui in poi CIBN) sono importanti per la dimerizzazione indotta dalla luce⁴⁶. Opto-Rho1DN contiene due componenti. Il primo componente è la proteina CIBN fusa con un’ancora CAAX, che localizza la proteina sulla membrana plasmatica⁴⁷. Il secondo componente è CRY2 marcato con mCherry fuso con Rho1DN⁴¹. In assenza di luce blu, CRY2-Rho1DN rimane nel citoplasma. Dopo la stimolazione con luce blu, CRY2-Rho1DN viene indirizzato alla membrana plasmatica attraverso l’interazione tra CIBN ancorato alla membrana e CRY2 eccitato. Opto-Rho1DN può essere attivato dalla luce ultravioletta A (UVA) e dalla luce blu (400-500 nm, picco di attivazione a 450-488 nm), o da un laser pulsato da 830-980 nm durante l’esecuzione di stimolazione a due fotoni^41,46,47,48. Pertanto, Opto-Rho1DN è stimolato dalle lunghezze d’onda normalmente utilizzate per eccitare la GFP (488 nm per l’imaging a singolo fotone e 920 nm per l’imaging a due fotoni). Al contrario, le lunghezze d’onda comunemente utilizzate per l’eccitazione di mCherry (561 nm per l’imaging a singolo fotone e 1.040 nm per l’imaging a due fotoni) non stimolano il modulo optogenetico e quindi possono essere utilizzate per l’imaging di pre-stimolazione. Il protocollo descrive gli approcci utilizzati per ridurre al minimo il rischio di stimolazione indesiderata durante la manipolazione del campione.

L’ablazione laser è stata ampiamente impiegata per rilevare e misurare la tensione nelle cellule e nei tessuti⁴⁹. Studi precedenti hanno dimostrato che, quando l’intensità del laser è adeguatamente controllata, l’ablazione laser a due fotoni che impiega un laser a femtosecondi nel vicino infrarosso può compromettere fisicamente alcune strutture subcellulari (ad esempio, le reti corticali di actomiosina) senza causare il rapimento della membrana plasmatica^50,51. Se il tessuto è sotto tensione, l’ablazione laser di una regione di interesse all’interno del tessuto provoca un immediato rinculo verso l’esterno delle cellule adiacenti alla regione ablata. La velocità di rinculo è funzione dell’entità della tensione e della viscosità del mezzo (citoplasma) che circonda le strutture sottoposte a rinculo⁴⁹. A causa della profondità di penetrazione superiore dei laser nel vicino infrarosso e della capacità di ottenere un’ablazione focale ben confinata, l’ablazione laser a due fotoni è particolarmente utile per rilevare la tensione dei tessuti in vivo. Come dimostrato in questo protocollo, questo metodo può essere facilmente combinato con l’inattivazione della contrattilità dell’actomiosina mediata da Opto-Rho1DN per studiare l’impatto diretto della contrattilità cellulare dipendente da Rho1 sulla meccanica tissutale durante il rimodellamento dinamico dei tessuti.

Protocol

1. Impostazione dell’incrocio genetico e preparazione del bicchiere per la raccolta degli ovuli Selezionare le femmine (vergini) della linea optogenetica UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) su un pad di CO2 sotto stereomicroscopio e allestito un incrocio con mosche maschi della linea driver GAL4 materna 67 Sqh-mCherry; 15 E-caderina-GFP.NOTA: Il 67 e il 15 stanno per Tubulina-GAL4 materna inserita rispettivamente nel secondo (II) e nel terzo (III) cromosomi<sup class=…

Representative Results

Negli embrioni non stimolati sottoposti a costrizione apicale, Sqh-mCherry si è arricchito nella regione medioapicale delle cellule mesodermiche ventrali, mentre CRY2-Rho1DN-mCherry era citosolico (Figura 1A). L’ablazione laser all’interno del dominio di costrizione ha portato a un rapido rinculo del tessuto lungo l’asse A-P (Figura 1B,C). Negli embrioni stimolati, il segnale CRY2-Rho1DN-mCherry è diventato localizzato sulla membrana plasmatic…

Discussion

Questo protocollo descriveva l’uso combinato dell’optogenetica e dell’ablazione laser per sondare i cambiamenti nella tensione tissutale immediatamente dopo l’inattivazione della contrattilità dell’actomiosina. Lo strumento optogenetico qui descritto sfrutta la forma negativa dominante di Rho1 (Rho1DN) per inibire in modo acuto la contrattilità endogena dell’actomiosina Rho1 e Rho1-dipendente. Una precedente caratterizzazione di Opto-Rho1DN nel contesto della formazione di solchi ventrali di Drosophila ha dimo…

Materials

35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation