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발생학

ショウ ジョウバエ 胚におけるRho1を介したアクトミオシン収縮性の光遺伝学的阻害と上皮圧の測定

Published: April 14, 2023
doi:
10.3791/65314
, ,
1Department of Biological Sciences,Dartmouth College, 2School of Life Sciences,Westlake University, 3Department of Molecular Biology,Princeton University

Summary

アクトミオシンの収縮性は、細胞および組織の形態形成において重要な役割を果たす。しかし、 生体内で アクトミオシンの収縮性を鋭く操作することは困難である。このプロトコルは、 ショウジョウバエ 胚におけるRho1を介したアクトミオシン収縮性を迅速に阻害する光遺伝学的システムを記述し、 in vivoでのアクトミオシンの不活性化後の上皮張力の即時喪失を明らかにしています。

Abstract

アクチンおよび非筋肉ミオシンIIによって生成される収縮力(「アクトミオシン収縮性」)は、細胞分裂、細胞遊走、上皮折り畳み、分岐形態形成など、複数の長さスケールでの細胞および組織の形態学的変化にとって重要です。形態形成におけるアクトミオシン収縮性の役割を深く理解するには、従来の遺伝学的または薬理学的アプローチでは達成が困難なアクトミオシンの迅速な不活性化を可能にするアプローチが必要です。提示されたプロトコルは、CRY2-CIBNベースの光遺伝学的二量体化システムであるOpto-Rho1DNを使用して、ショ ウジョウバエ 胚のアクトミオシン収縮性を阻害し、正確な時間的および空間的制御を行うことを実証しています。このシステムでは、CRY2はドミナントネガティブ型のRho1(Rho1DN)に融合し、CIBNは原形質膜に固定されています。CRY2とCIBNの青色光を介した二量体化は、細胞質から原形質膜へのRho1DNの急速な移行をもたらし、内因性Rho1を阻害することによってアクトミオシンを不活性化します。さらに、この記事では、ショウ ジョウバエ 腹側溝形成中の上皮張力の生成におけるアクトミオシンの役割を調査するために、Opto-Rho1DNを介したアクトミオシンの不活性化とレーザーアブレーションを組み合わせるための詳細なプロトコルを紹介します。このプロトコルは、ショ ウジョウバエ 胚におけるアクトミオシン収縮性を含む他の多くの形態学的プロセスに最小限の修飾で適用することができる。全体として、この光遺伝学的ツールは、動的組織リモデリング中の組織力学の制御におけるアクトミオシン収縮性の機能を分析するための強力なアプローチです。

Introduction

アクトミオシンの収縮性は、非筋ミオシンII(以下、ミオシン)がF-アクチンネットワークに及ぼす収縮力であり、細胞の形状を変化させ、組織レベルの形態形成を促進する上で最も重要な力の1つです1,2。例えば、上皮細胞の頂端ドメインにおけるアクトミオシン収縮性の活性化は、頂端狭窄をもたらし、これは、上皮折り畳み、細胞押し出し、層間剥離、および創傷治癒を含む様々な形態形成プロセスを促進する3,4,5,6,7 .ミオシンの活性化は、その調節軽鎖のリン酸化を必要とする。この修飾は、ミオシン分子の阻害的立体配座を緩和し、それらが両端に複数のヘッドドメインを有する双極性ミオシンフィラメントバンドルを形成することを可能にする。バイポーラミオシンフィラメントは、アクチンフィラメントの反平行運動を駆動し、収縮力の生成をもたらします1,8,9。

進化的に保存されたRhoファミリーの小型GTPase RhoA(ショウジョウバエのRho1)は、さまざまな細胞状況におけるアクトミオシン収縮性の活性化において中心的な役割を果たしています10,11。Rho1は、GTP(活性型)またはGDP(不活性型)のいずれかに結合することにより、二分子スイッチとして機能します12。GTPまたはGDPに結合したRho1間の循環は、GTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)とグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)によって調節されています13。GEFは、GDPとGTPの交換を促進し、Rho1活性を活性化するように機能します。一方、GAPはRho1のGTPアーゼ活性を増強し、Rho1を不活性化します。活性化されたRho1は、その下流のエフェクターであるRho関連キナーゼ(Rok)およびDiaphanous14と相互作用して活性化することにより、アクトミオシンの収縮性を促進します。Rokは、ミオシン15の調節軽鎖をリン酸化することによりミオシン活性化およびアクトミオシン収縮性を誘導する。加えて、Rokはまた、ミオシン調節軽鎖ホスファターゼを阻害し、したがってミオシンフィラメント集合体をさらに促進する16。Rokはまた、LIMキナーゼをリン酸化することができ、活性化されると、アクチン解重合因子コフィリン17,18をリン酸化および阻害することにより、アクチンの分解を防ぎます。Diaphaousは、アクチン重合を促進するホルミンファミリーアクチン核物質であり、ミオシンが19,20,21と相互作用するための塩基を提供します。

アクトミオシンの収縮性を活性化する細胞機構は十分に解明されていますが、動的組織リモデリングの制御におけるアクトミオシンの機能についての理解は未完了です。この知識のギャップを埋めるには、in vivoの特定の組織領域でアクトミオシンを迅速に不活性化し、組織の挙動と特性への即時の影響を記録できるアプローチが必要です。このプロトコルは、ショウジョウバエ中胚葉陥入中のアクトミオシン収縮性を急性に阻害するための光遺伝学的アプローチの使用と、それに続くレーザーアブレーションを使用した上皮張力の測定について説明しています。ショウジョウバエ原腸形成の間、腹側に局在する中胚葉前駆細胞は、前後向きの溝を形成することによって胚の表面から頂端狭窄を受け、陥入する22,23。腹側の溝の形成は、上皮折り畳みのメカニズムを研究するためのモデルとして長い間使用されてきました。腹側溝形成は、ショウジョウバエ24,25,26,27の背側-腹側パターンシステムによって管理されます。胚の腹側に位置する2つの転写因子、ツイストとカタツムリの発現は、腹側の溝の形成を制御し、中胚葉細胞の運命を特定します28。ツイストとカタツムリは、Gタンパク質共役受容体経路とRhoGEF2アダプタータンパク質T48を介して、中胚葉前駆細胞の頂点へのRho1 GEF RhoGEF2の動員を活性化しますT48 29,30,31,32,33.次に、RhoGEF2は、Rho−Rhoキナーゼ経路34、35、36、37、38、39を介して、潜在的な中胚葉の頂端表面全体にわたってミオシンを活性化する。活性化されたミオシンは、中胚葉原基の頂端表面全体に細胞上アクトミオシンネットワークを形成し、その収縮は頂端狭窄を引き起こし、頂端組織の張力の急速な増加をもたらす14,37,40。

このプロトコルに記載されている光遺伝学的ツールであるOpto-Rho1DNは、優性陰性のRho1(Rho1DN)41の青色光依存性原形質膜動員を介してアクトミオシン収縮性を阻害します。Rho1DNのT19N変異は、変異タンパク質がGDPをGTPと交換する能力を排除し、したがってタンパク質を永久に不活性にします34。その後のRho1DNの変異であるC189Yは、そのナイーブ膜ターゲティングシグナル42,43を排除します。Rho1DNが原形質膜に注入されると、Rho1 GEFに結合して包囲し、それによってRho1の活性化とミオシンおよびアクチンのRho1を介した活性化をブロックします34,44。Rho1DNの原形質膜動員は、クリプトクロム2とその結合パートナーであるCIB1に由来する光依存性二量体化モジュールによって達成されます。クリプトクロム2は、シロイヌナズナ45の青色光活性化クリプトクロム光受容体である。クリプトクロム2は、光励起状態でのみ、塩基性らせん-ループ-らせんタンパク質であるCIB1に結合します45。その後、クリプトクロム2(CRY2PHR、以下CRY2と呼ぶ)とCIB1(以下CIBN)のN末端ドメイン(aa 1-170)から保存されたN末端フォトリアーゼ相同性領域(PHR)が光誘起二量体化に重要であることが判明した46。Opto-Rho1DNには2つのコンポーネントが含まれています。第1の構成要素は、CAAXアンカーと融合したCIBNタンパク質であり、これは、タンパク質を原形質膜47に局在化する。2番目のコンポーネントは、Rho1DN41と融合したmCherryタグ付きCRY2です。青色光がない場合、CRY2-Rho1DNは細胞質内に残ります。青色光刺激により、CRY2-Rho1DNは、膜固定CIBNと励起CRY2との間の相互作用を介して原形質膜に標的化される。Opto-Rho1DNは、紫外線A(UVA)光と青色光(400-500 nm、450-488 nmでのピーク活性化)、または2光子刺激を行う場合は830-980 nmパルスレーザーによって活性化することができます41,46,47,48。したがって、Opto-Rho1DNは、GFPの励起に通常使用される波長(単一光子イメージングでは488 nm、2光子イメージングでは920 nm)によって刺激されます。対照的に、mCherryの励起に一般的に使用される波長(単一光子イメージングの場合は561 nm、2光子イメージングの場合は1,040 nm)は、光遺伝学的モジュールを刺激しないため、刺激前のイメージングに使用できます。このプロトコルは、サンプル操作中の不要な刺激のリスクを最小限に抑えるために使用されるアプローチを説明しています。

レーザーアブレーションは、細胞および組織における張力を検出および測定するために広く用いられている49。以前の研究では、レーザー強度が適切に制御されている場合、フェムト秒近赤外レーザーを用いた2光子レーザーアブレーションは、原形質膜の歓喜を引き起こすことなく、いくつかの細胞内構造(例えば、皮質アクトミオシンネットワーク)を物理的に損なう可能性があることが示されています50,51。組織が張力下にある場合、組織内の関心領域のレーザーアブレーションは、切除領域に隣接する細胞の即時外向きの反動をもたらす。反跳速度は、反跳49を受ける構造を取り囲む媒体(細胞質)の張力および粘度の大きさの関数である。近赤外レーザーの優れた浸透深さと十分に閉じ込められた焦点アブレーションを達成する能力のために、二光子レーザーアブレーションはin vivoでの組織張力を検出するのに特に有用です。このプロトコルで実証されているように、この方法は、Opto-Rho1DNを介したアクトミオシン収縮性の不活性化と簡単に組み合わせて、動的組織リモデリング中の組織力学に対するRho1依存性細胞収縮性の直接的な影響を調べることができます。

Protocol

1.遺伝子交配の設定と採卵カップの準備 光遺伝学系統UASp-CIBNpm(I)から雌のハエ(処女)を選択する。実体顕微鏡下のCO2 パッド上にUASp-CRY2-Rho1DN-mCherry(III)を設置し、母方のGAL4ドライバーライン67Sqh-mCherryからのオスのハエとの交配を設置した。15 E-カドヘリン-GFP。注:67と15は、それぞれ2番目(II)と3番目(III)の染色体に挿入された母体チューブリン-GAL4を表します<sup class…

Representative Results

頂端狭窄を受けた無刺激胚では、Sqh-mCherryは腹側中胚葉細胞の中頂部で濃縮されたのに対し、CRY2-Rho1DN-mCherryは細胞質ゾルであった(図1A)。狭窄領域内でのレーザーアブレーションは、A-P軸に沿った急速な組織反動をもたらしました(図1B、C)。刺激された胚では、CRY2-Rho1DN-mCherryシグナルは原形質膜に局在するようになりましたが、Sqh-mCherr…

Discussion

このプロトコルは、アクトミオシン収縮性の不活性化直後の組織張力の変化をプローブするためのオプトジェネティクスとレーザーアブレーションの併用について説明しました。ここで説明する光遺伝学的ツールは、Rho1(Rho1DN)のドミナントネガティブ型を利用して、内因性Rho1およびRho1依存性アクトミオシン収縮性を急激に阻害します。ショウジョウバエ腹側溝形成の文脈におけるOpto-…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、画像のサポートについてAnn Lavanwayに感謝しています。著者らは、試薬を共有してくれたヴィーシャウス研究所とデ・レンツィス研究所、フライストックについてブルーミントンショウジョウバエストックセンターに感謝しています。この研究は、NIGMS ESI-MIRA R35GM128745および米国癌協会機関研究助成金 #IRG-82-003-33からBHの支援を受けています。

Materials

35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation
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Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).
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