Оптогенетическое ингибирование Rho1-опосредованной сократимости актомиозина в сочетании с измерением эпителиального натяжения у эмбрионов дрозофилы
Summary
Сократительная способность актомиозина играет важную роль в морфогенезе клеток и тканей. Тем не менее, сложно оперативно манипулировать сократительной способностью актомиозина in vivo . Этот протокол описывает оптогенетическую систему, которая быстро ингибирует Rho1-опосредованную сократительную способность актомиозина у эмбрионов дрозофилы , выявляя немедленную потерю эпителиального напряжения после инактивации актомиозина in vivo.
Abstract
Сократительные силы, генерируемые актином и немышечным миозином II («сократительная способность актомиозина»), имеют решающее значение для морфологических изменений клеток и тканей в различных масштабах длины, таких как деление клеток, миграция клеток, сворачивание эпителия и морфогенез ветвления. Глубокое понимание роли сократительной способности актомиозина в морфогенезе требует подходов, позволяющих осуществлять быструю инактивацию актомиозина, чего трудно достичь с помощью традиционных генетических или фармакологических подходов. Представленный протокол демонстрирует использование системы оптогенетической димеризации Opto-Rho1DN на основе CRY2-CIBN для ингибирования сократительной способности актомиозина у эмбрионов дрозофилы с точным временным и пространственным контролем. В этой системе CRY2 сливается с доминирующей отрицательной формой Rho1 (Rho1DN), тогда как CIBN закрепляется на плазматической мембране. Опосредованная синим светом димеризация CRY2 и CIBN приводит к быстрой транслокации Rho1DN из цитоплазмы в плазматическую мембрану, где он инактивирует актомиозин путем ингибирования эндогенного Rho1. Кроме того, в данной статье представлен подробный протокол сопряжения Opto-Rho1DN-опосредованной инактивации актомиозина с лазерной абляцией для изучения роли актомиозина в генерации эпителиального натяжения при формировании вентральной борозды дрозофилы . Этот протокол может быть применен ко многим другим морфологическим процессам, включающим сократительную способность актомиозина у эмбрионов дрозофилы с минимальными модификациями. В целом, этот оптогенетический инструмент является мощным подходом к анализу функции сократительной способности актомиозина в контроле механики тканей во время динамического ремоделирования тканей.
Introduction
Сократительная способность актомиозина, сократительная сила, оказываемая немышечным миозином II (далее «миозин») на F-актиновую сеть, является одной из наиболее важных сил в изменении формы клеток и управлении морфогенезом на тканевом уровне 1,2. Например, активация сократительной способности актомиозина в апикальном домене эпителиальных клеток приводит к апикальному сужению, что способствует различным морфогенетическим процессам, включая сворачивание эпителия, экструзию клеток, расслоение и заживление ран 3,4,5,6,7 . Активация миозина требует фосфорилирования его регуляторной легкой цепи. Эта модификация ослабляет ингибирующую конформацию молекул миозина, позволяя им образовывать биполярные пучки миозиновых филаментов с несколькими головными доменами на обоих концах. Биполярные миозиновые филаменты управляют антипараллельным движением актиновых филаментов и приводят к генерации сократительной силы 1,8,9.
Эволюционно консервативная малая ГТФаза семейства Rho RhoA (Rho1 у дрозофилы) играет центральную роль в активации сократительной способности актомиозина в различных клеточных контекстах10,11. Rho1 функционирует как бимолекулярный переключатель, связывая либо GTP (активная форма), либо GDP (неактивная форма)12. Цикл между ГТФ- или ГДФ-связанным Rho1 регулируется его ГТФаза-активирующими белками (GAP) и гуаниновыми нуклеотидными факторами обмена (ГЭФ)13. ГЭФ функционируют для облегчения обмена ВВП на ГТП и, таким образом, активизируют деятельность Rho1. GAPs, с другой стороны, усиливают активность ГТФазы Rho1 и, таким образом, деактивируют Rho1. Активированный Rho1 способствует сократительной способности актомиозина, взаимодействуя и активируя его нижележащие эффекторы, Rho-ассоциированную киназу (Rok) и Diaphanous14. Rok индуцирует активацию миозина и сократительную способность актомиозина путем фосфорилирования регуляторной легкой цепи миозина15. Кроме того, Rok также ингибирует миозин-регуляторную фосфатазу легкой цепи и, следовательно, способствует дальнейшей сборке миозиновых филаментов16. Rok также может фосфорилировать киназы LIM, которые при активации предотвращают распад актина путем фосфорилирования и ингибирования фактора деполимеризации актинакофилина 17,18. Diaphanous – это актиновый нуклеатор семейства форминов, который способствует полимеризации актина, обеспечивая основу для взаимодействия миозина с 19,20,21.
В то время как клеточные механизмы, активирующие сократительную способность актомиозина, хорошо изучены, наше понимание его функции в регуляции динамического ремоделирования тканей остается неполным. Чтобы восполнить этот пробел в знаниях, требуются подходы, которые могут быстро инактивировать актомиозин в определенных участках тканей in vivo и регистрировать непосредственное влияние на поведение и свойства тканей. В данном протоколе описано использование оптогенетического подхода для резкого ингибирования сократительной способности актомиозина при инвагинации мезодермы дрозофилы с последующим измерением натяжения эпителия с помощью лазерной абляции. Во время гаструляции дрозофилы вентрально локализованные клетки-предшественники мезодермы подвергаются апикальному сужению и инвагинируются с поверхности эмбриона, образуя передне-заднюю ориентированную борозду22,23. Образование вентральных борозд издавна использовалось в качестве модели для изучения механизма складчатости эпителия. Формирование вентральной борозды осуществляется дорсально-вентральной системой паттерна у дрозофилы24,25,26,27. Экспрессия двух транскрипционных факторов, Twist и Snail, расположенных на вентральной стороне эмбриона, контролирует формирование вентральной борозды и определяет судьбу мезодермальных клеток28. Twist и Snail активируют рекрутирование Rho1 GEF RhoGEF2 к вершине клеток-предшественников мезодермы через рецепторный путь, связанный с G-белком, и адапторный белок RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. Затем RhoGEF2 активирует миозин по всей апикальной поверхности потенциальной мезодермы через путь Rho-Rho киназы 34,35,36,37,38,39. Активированный миозин образует надклеточную актомиозиновую сеть по всей апикальной поверхности зачатка мезодермы, сокращения которой приводят к сужению апикальной ткани и приводят к быстрому увеличению натяжения апикальной ткани 14,37,40.
Оптогенетический инструмент, описанный в этом протоколе, Opto-Rho1DN, ингибирует сократительную способность актомиозина через зависимую от синего света рекрутацию плазматической мембраной доминантной отрицательной формы Rho1 (Rho1DN)41. Мутация T19N в Rho1DN устраняет способность мутантного белка обменивать GDP на GTP и, таким образом, делает белоквечно неактивным. Последующая мутация в Rho1DN, C189Y, устраняет его наивный сигнал нацеливания на мембрану42,43. Когда Rho1DN вводится в плазматическую мембрану, он связывается с Rho1 GEF и захватывает их, тем самым блокируя активацию Rho1, а также Rho1-опосредованную активацию миозина и актина34,44. Рекрутирование Rho1DN плазматической мембраной достигается с помощью светозависимого модуля димеризации, полученного из Cryptochrome 2 и его связывающего партнера CIB1. Криптохром 2 представляет собой фоторецептор криптохрома, активируемый синим светом, у Arabidopsis thaliana45. Криптохром 2 связывается с CIB1, основным белком спирали-петля-спираль, только в его фотовозбужденном состоянии45. Позже было обнаружено, что консервативная N-концевая область гомологии фотолиазы (PHR) из криптохрома 2 (CRY2PHR, далее именуемая CRY2) и N-концевой домен (aa 1-170) CIB1 (далее CIBN) важны для светоиндуцированной димеризации46. Opto-Rho1DN содержит два компонента. Первым компонентом является белок CIBN, слитый с якорем CAAX, который локализует белок на плазматической мембране47. Второй компонент — CRY2 с мечением mCherry, сплавленный с Rho1DN41. При отсутствии синего света CRY2-Rho1DN остается в цитоплазме. При стимуляции синим светом CRY2-Rho1DN воздействует на плазматическую мембрану посредством взаимодействия между мембранозакрепленным CIBN и возбужденным CRY2. Opto-Rho1DN может быть активирован ультрафиолетовым светом A (UVA) и синим светом (400-500 нм, пик активации 450-488 нм) или импульсным лазером 830-980 нм при выполнении двухфотонной стимуляции41,46,47,48. Таким образом, Opto-Rho1DN стимулируется длинами волн, обычно используемыми для возбуждения GFP (488 нм для однофотонной визуализации и 920 нм для двухфотонной визуализации). В отличие от этого, длины волн, обычно используемые для возбуждения mCherry (561 нм для однофотонной визуализации и 1040 нм для двухфотонной визуализации), не стимулируют оптогенетический модуль и, следовательно, могут быть использованы для предстимуляционной визуализации. Протокол описывает подходы, используемые для минимизации риска нежелательной стимуляции во время манипуляций с образцом.
Лазерная абляция широко используется для обнаружения и измерения напряжения в клетках и тканях49. Предыдущие исследования показали, что при надлежащем контроле интенсивности лазера двухфотонная лазерная абляция с использованием фемтосекундного лазера ближнего инфракрасного диапазона может физически повредить некоторые субклеточные структуры (например, кортикальные актомиозиновые сети), не вызывая разрыва плазматической мембраны. Если ткань находится под напряжением, лазерная абляция интересующей области внутри ткани приводит к немедленной отдаче наружу клеток, прилегающих к абляционной области. Скорость отдачи является функцией величины натяжения и вязкости среды (цитоплазмы), окружающей структуры, подвергающиеся отдаче49. Из-за превосходной глубины проникновения лазеров ближнего инфракрасного диапазона и способности достигать хорошо ограниченной фокальной абляции, двухфотонная лазерная абляция особенно полезна для обнаружения натяжения тканей in vivo. Как показано в этом протоколе, этот метод может быть легко комбинирован с опто-Rho1DN-опосредованной инактивацией сократимости актомиозина для исследования прямого влияния Rho1-зависимой клеточной сократимости на механику тканей во время динамического ремоделирования тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывал комбинированное использование оптогенетики и лазерной абляции для зондирования изменений натяжения тканей сразу после инактивации сократимости актомиозина. Оптогенетический инструмент, описанный здесь, использует преимущества доминантной негативной формы R…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Энн Лавануэй (Ann Lavanway) за помощь в создании изображений. Авторы благодарят лабораторию Вишауса и лабораторию Де Ренциса за обмен реагентами, а также Блумингтонский центр разведения дрозофил за запасы мух. Это исследование поддержано NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 и грантом Американского онкологического общества на институциональные исследования #IRG-82-003-33 для BH.
Materials
| 35 mm glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | Used for sample preparation |
| 60 mm × 15 mm Petri dish with lid | Falcon | 351007 | Used for sample preparation |
| Black cloth for covering the microscope | Online | NA | Used to avoid unwanted light stimulation |
| Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) | VWR | 10028-048 | Used for embryo dechorination |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | Used for cross set-up |
| ddH2O | NA | NA | Used for sample preparation |
| Dumont Style 5 tweezers | VWR | 102091-654 | Used for sample preparation |
| Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) | VWR | 22940-834 | Used for sample preparation |
| FluoView (Software) | Olympus | NA | Used for image acquisition and optogenetic stimulation |
| Halocarbon oil 27 | Sigma Aldrich | H8773-100ML | Used for embryo stage visualization |
| ImageJ/FIJI | NIH | NA | Used for image analysis |
| MATLAB | MathWorks | NA | Used for image analysis |
| Nikon SMZ-745 stereoscope | Nikon | NA | Used for sample preparation |
| Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. | Olympus | NA | Used for image acquisition and optogenetic stimulation |
| SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) | VWR | 30621-392 | Used to avoid unwanted light stimulation |
| UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) | Bolioptics | FM14036151 | Used to avoid unwanted light stimulation |
| VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights | Amazon | NA | Used to avoid unwanted light stimulation |
References
- Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
- Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
- Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. 발생학. 341 (1), 5-19 (2010).
- Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
- Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
- Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
- Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
- Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
- Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
- Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
- Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
- Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
- Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
- Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
- Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
- Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
- Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
- Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
- Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
- Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
- Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
- Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. 유전학. 214 (3), 543-560 (2020).
- Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
- Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -. A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
- Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
- Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
- Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
- Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
- Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
- Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
- Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
- Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
- Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
- Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
- Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
- Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
- Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
- Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
- Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
- Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
- Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
- Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
- Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
- Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
- Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
- Munjal, A., Philippe, J. -. M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
- Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
- Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
- Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).
