Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila
Summary
La contractilidad de la actomiosina juega un papel importante en la morfogénesis celular y tisular. Sin embargo, es difícil manipular la contractilidad de la actomiosina in vivo de forma aguda. Este protocolo describe un sistema optogenético que inhibe rápidamente la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 en embriones de Drosophila , revelando la pérdida inmediata de la tensión epitelial después de la inactivación de la actomiosina in vivo.
Abstract
Las fuerzas contráctiles generadas por la actina y la miosina II no muscular (“contractilidad de la actomiosina”) son críticas para los cambios morfológicos de las células y los tejidos a múltiples escalas de longitud, como la división celular, la migración celular, el plegamiento epitelial y la morfogénesis ramificada. Una comprensión profunda del papel de la contractilidad de la actomiosina en la morfogénesis requiere enfoques que permitan la rápida inactivación de la actomiosina, lo cual es difícil de lograr utilizando enfoques genéticos o farmacológicos convencionales. El protocolo presentado demuestra el uso de un sistema de dimerización optogenética basado en CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, para inhibir la contractilidad de la actomiosina en embriones de Drosophila con controles temporales y espaciales precisos. En este sistema, CRY2 se fusiona con la forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN), mientras que CIBN se ancla a la membrana plasmática. La dimerización mediada por luz azul de CRY2 y CIBN da lugar a una rápida translocación de Rho1DN desde el citoplasma a la membrana plasmática, donde inactiva la actomiosina mediante la inhibición endógena de Rho1. Además, este artículo presenta un protocolo detallado para acoplar la inactivación mediada por Opto-Rho1DN de la actomiosina con la ablación con láser para investigar el papel de la actomiosina en la generación de tensión epitelial durante la formación del surco ventral de Drosophila . Este protocolo se puede aplicar a muchos otros procesos morfológicos que involucran la contractilidad de la actomiosina en embriones de Drosophila con modificaciones mínimas. En general, esta herramienta optogenética es un enfoque poderoso para diseccionar la función de la contractilidad de la actomiosina en el control de la mecánica tisular durante la remodelación tisular dinámica.
Introduction
La contractilidad de la actomiosina, la fuerza contráctil ejercida por la miosina II no muscular (en adelante, «miosina») sobre la red de actina F, es una de las fuerzas más importantes en el cambio de la forma celular y en la morfogénesis a nivel tisular 1,2. Por ejemplo, la activación de la contractilidad de la actomiosina en el dominio apical de las células epiteliales da lugar a la constricción apical, lo que facilita una variedad de procesos morfogenéticos, incluido el plegamiento epitelial, la extrusión celular, la delaminación y la cicatrización de heridas 3,4,5,6,7 . La activación de la miosina requiere la fosforilación de su cadena ligera reguladora. Esta modificación alivia la conformación inhibitoria de las moléculas de miosina, permitiéndoles formar haces de filamentos de miosina bipolares con múltiples dominios de cabeza en ambos extremos. Los filamentos bipolares de miosina impulsan el movimiento antiparalelo de los filamentos de actina y dan lugar a la generación de fuerza contráctil 1,8,9.
La pequeña GTPasa RhoA (Rho1 en Drosophila), conservada evolutivamente, desempeña un papel central en la activación de la contractilidad de la actomiosina en diversos contextos celulares10,11. Rho1 funciona como un interruptor bimolecular al unirse a GTP (forma activa) o GDP (forma inactiva)12. El ciclo entre Rho1 unido a GTP o GDP está regulado por sus proteínas activadoras de GTPasa (GAPs) y factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs)13. La función de los FMAM es facilitar el intercambio del PIB por el PIB y activar así la actividad de Rho1. Los GAPs, por otro lado, mejoran la actividad GTPasa de Rho1 y, por lo tanto, desactivan Rho1. La Rho1 activada promueve la contractilidad de la actomiosina a través de la interacción y la activación de sus efectores posteriores, la quinasa asociada a Rho (Rok) y la diáfana14. Rok induce la activación de la miosina y la contractilidad de la actomiosina mediante la fosforilación de la cadena ligera reguladora de la miosina15. Además, Rok también inhibe la fosfatasa de cadena ligera reguladora de la miosina y, por lo tanto, promueve aún más el ensamblaje del filamento de miosina16. Rok también puede fosforilar las quinasas LIM, que, cuando se activan, evitan el desensamblaje de la actina al fosforilar e inhibir el factor de despolimerización de actina cofilina17,18. Diaphanous es un nucleador de actina de la familia de las forminas que promueve la polimerización de la actina, proporcionando una base para que la miosina interactúe con 19,20,21.
Si bien los mecanismos celulares que activan la contractilidad de la actomiosina han sido bien dilucidados, nuestra comprensión de su función en la regulación de la remodelación dinámica de los tejidos sigue siendo incompleta. Llenar este vacío de conocimiento requiere enfoques que puedan inactivar rápidamente la actomiosina en regiones específicas del tejido in vivo y registrar el impacto inmediato en el comportamiento y las propiedades de los tejidos. Este protocolo describe el uso de un enfoque optogenético para inhibir agudamente la contractilidad de la actomiosina durante la invaginación del mesodermo de Drosophila, seguida de la medición de la tensión epitelial mediante ablación láser. Durante la gastrulación de Drosophila, las células precursoras del mesodermo localizadas ventralmente sufren constricción apical y se invaginan desde la superficie del embrión formando un surco orientado antero-posterior22,23. La formación de surcos ventrales se ha utilizado durante mucho tiempo como modelo para estudiar el mecanismo de plegamiento epitelial. La formación del surco ventral es administrada por el sistema de patrones dorsal-ventral en Drosophila24,25,26,27. La expresión de dos factores de transcripción, Twist y Snail, localizados en el lado ventral del embrión, controla la formación del surco ventral y especifica el destino de las células mesodérmicas28. Twist y Snail activan el reclutamiento de Rho1 GEF RhoGEF2 al ápice de las células precursoras del mesodermo a través de una vía receptora acoplada a proteína G y una proteína adaptadora RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. A continuación, RhoGEF2 activa la miosina en toda la superficie apical del mesodermo potencial a través de la vía de la quinasa Rho-Rho 34,35,36,37,38,39. La miosina activada forma una red supracelular de actomiosina a lo largo de la superficie apical del primordio del mesodermo, cuyas contracciones impulsan la constricción apical y dan lugar a un rápido aumento de la tensión del tejido apical 14,37,40.
La herramienta optogenética descrita en este protocolo, Opto-Rho1DN, inhibe la contractilidad de la actomiosina a través del reclutamiento en la membrana plasmática dependiente de la luz azul de una forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN)41. Una mutación T19N en Rho1DN elimina la capacidad de la proteína mutante para intercambiar GDP por GTP y, por lo tanto, hace que la proteína esté perpetuamente inactiva34. Una mutación posterior en Rho1DN, C189Y, elimina su señal de direccionamiento de membrana 42,43. Cuando Rho1DN se infunde en la membrana plasmática, se une a los GEF de Rho1 y los incauta, bloqueando así la activación de Rho1, así como la activación mediada por Rho1 de la miosina y la actina34,44. El reclutamiento de Rho1DN en la membrana plasmática se logra a través de un módulo de dimerización dependiente de la luz derivado del criptocromo 2 y su socio de unión CIB1. El criptocromo 2 es un fotorreceptor criptocromo activado por luz azul en Arabidopsis thaliana45. El criptocromo 2 se une a CIB1, una proteína básica de hélice-bucle-hélice, solo en su estado fotoexcitado45. Más tarde se descubrió que la región de homología de fotoliasa (PHR) N-terminal conservada del criptocromo 2 (CRY2PHR, en lo sucesivo denominado CRY2) y el dominio N-terminal (aa 1-170) de CIB1 (en adelante CIBN) son importantes para la dimerización inducida por la luz46. Opto-Rho1DN contiene dos componentes. El primer componente es la proteína CIBN fusionada con un anclaje CAAX, que localiza la proteína en la membrana plasmática47. El segundo componente es CRY2 marcado con mCherry fusionado con Rho1DN41. En ausencia de luz azul, CRY2-Rho1DN permanece en el citoplasma. Tras la estimulación con luz azul, CRY2-Rho1DN se dirige a la membrana plasmática a través de la interacción entre el CIBN anclado a la membrana y el CRY2 excitado. Opto-Rho1DN puede ser activado por luz ultravioleta A (UVA) y luz azul (400-500 nm, activación máxima a 450-488 nm), o por un láser pulsado de 830-980 nm cuando se realiza la estimulación de dos fotones41,46,47,48. Por lo tanto, Opto-Rho1DN es estimulado por las longitudes de onda normalmente utilizadas para excitar la GFP (488 nm para imágenes de fotón único y 920 nm para imágenes de dos fotones). Por el contrario, las longitudes de onda comúnmente utilizadas para excitar mCherry (561 nm para imágenes de fotón único y 1.040 nm para imágenes de dos fotones) no estimulan el módulo optogenético y, por lo tanto, se pueden usar para imágenes de preestimulación. El protocolo describe los enfoques utilizados para minimizar el riesgo de estimulación no deseada durante la manipulación de la muestra.
La ablación con láser se ha empleado ampliamente para detectar y medir la tensión en células y tejidos49. Estudios previos han demostrado que, cuando la intensidad del láser se controla adecuadamente, la ablación con láser de dos fotones que emplea un láser de infrarrojo cercano de femtosegundos puede dañar físicamente algunas estructuras subcelulares (por ejemplo, redes corticales de actomiosina) sin causar el éxtasis de la membrana plasmática50,51. Si el tejido está bajo tensión, la ablación con láser de una región de interés dentro del tejido da como resultado un retroceso inmediato hacia afuera de las células adyacentes a la región ablacionada. La velocidad de retroceso es una función de la magnitud de la tensión y la viscosidad del medio (citoplasma) que rodea las estructuras que sufren retroceso49. Debido a la profundidad de penetración superior de los láseres de infrarrojo cercano y la capacidad de lograr una ablación focal bien confinada, la ablación con láser de dos fotones es particularmente útil para detectar la tensión tisular in vivo. Como se demuestra en este protocolo, este método puede combinarse fácilmente con la inactivación mediada por Opto-Rho1DN de la contractilidad de la actomiosina para investigar el impacto directo de la contractilidad celular dependiente de Rho1 en la mecánica tisular durante la remodelación tisular dinámica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe el uso combinado de la optogenética y la ablación con láser para sondear los cambios en la tensión tisular inmediatamente después de la inactivación de la contractilidad de la actomiosina. La herramienta optogenética descrita aquí aprovecha la forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN) para inhibir agudamente la contractilidad endógena de Rho1 y actomiosina dependiente de Rho1. La caracterización previa de Opto-Rho1DN en el contexto de la formación del surco ventral de Drosophila</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Ann Lavanway por el apoyo a las imágenes. Los autores agradecen al laboratorio de Wieschaus y al laboratorio de De Renzis por compartir reactivos y al Bloomington Drosophila Stock Center por las poblaciones de moscas. Este estudio cuenta con el apoyo de NIGMS, ESI-MIRA R35GM128745 y la Subvención de Investigación Institucional de la Sociedad Americana Contra El Cáncer #IRG-82-003-33 a BH.
Materials
| 35 mm glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | Used for sample preparation |
| 60 mm × 15 mm Petri dish with lid | Falcon | 351007 | Used for sample preparation |
| Black cloth for covering the microscope | Online | NA | Used to avoid unwanted light stimulation |
| Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) | VWR | 10028-048 | Used for embryo dechorination |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | Used for cross set-up |
| ddH2O | NA | NA | Used for sample preparation |
| Dumont Style 5 tweezers | VWR | 102091-654 | Used for sample preparation |
| Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) | VWR | 22940-834 | Used for sample preparation |
| FluoView (Software) | Olympus | NA | Used for image acquisition and optogenetic stimulation |
| Halocarbon oil 27 | Sigma Aldrich | H8773-100ML | Used for embryo stage visualization |
| ImageJ/FIJI | NIH | NA | Used for image analysis |
| MATLAB | MathWorks | NA | Used for image analysis |
| Nikon SMZ-745 stereoscope | Nikon | NA | Used for sample preparation |
| Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. | Olympus | NA | Used for image acquisition and optogenetic stimulation |
| SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) | VWR | 30621-392 | Used to avoid unwanted light stimulation |
| UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) | Bolioptics | FM14036151 | Used to avoid unwanted light stimulation |
| VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights | Amazon | NA | Used to avoid unwanted light stimulation |
References
- Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
- Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
- Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. 발생학. 341 (1), 5-19 (2010).
- Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
- Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
- Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
- Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
- Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
- Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
- Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
- Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
- Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
- Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
- Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
- Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
- Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
- Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
- Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
- Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
- Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
- Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
- Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. 유전학. 214 (3), 543-560 (2020).
- Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
- Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -. A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
- Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
- Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
- Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
- Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
- Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
- Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
- Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
- Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
- Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
- Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
- Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
- Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
- Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
- Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
- Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
- Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
- Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
- Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
- Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
- Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
- Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
- Munjal, A., Philippe, J. -. M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
- Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
- Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
- Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).
