JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
발생학

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة

Published: April 14, 2023
doi:
10.3791/65314
, ,
1Department of Biological Sciences,Dartmouth College, 2School of Life Sciences,Westlake University, 3Department of Molecular Biology,Princeton University

Summary

يلعب انقباض Actomyosin دورا مهما في تكوين الخلايا والأنسجة. ومع ذلك ، من الصعب التلاعب بانقباض الأكتوميوسين في الجسم الحي بشكل حاد. يصف هذا البروتوكول نظاما بصريا وراثيا يثبط بسرعة انقباض الأكتوميوسين بوساطة Rho1 في أجنة ذبابة الفاكهة ، مما يكشف عن الفقدان الفوري للتوتر الظهاري بعد تعطيل الأكتوميوسين في الجسم الحي.

Abstract

تعتبر القوى المقلصة الناتجة عن الأكتين والميوسين الثاني غير العضلي (“انقباض الأكتوميوسين”) ضرورية للتغيرات المورفولوجية للخلايا والأنسجة على مقاييس طول متعددة ، مثل انقسام الخلايا ، وهجرة الخلايا ، والطي الظهاري ، والتشكل المتفرع. يتطلب الفهم المتعمق لدور انقباض الأكتوميوسين في التشكل مناهج تسمح بالتعطيل السريع للأكتوميوسين ، وهو أمر يصعب تحقيقه باستخدام الأساليب الجينية أو الدوائية التقليدية. يوضح البروتوكول المقدم استخدام نظام dimerization البصري الوراثي القائم على CRY2-CIBN ، Opto-Rho1DN ، لمنع انقباض الأكتوميوسين في أجنة ذبابة الفاكهة مع ضوابط زمنية ومكانية دقيقة. في هذا النظام ، يتم دمج CRY2 في الشكل السلبي السائد ل Rho1 (Rho1DN) ، بينما يتم تثبيت CIBN على غشاء البلازما. يؤدي التثبيط بوساطة الضوء الأزرق ل CRY2 و CIBN إلى الانتقال السريع ل Rho1DN من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما ، حيث يثبط نشاط الأكتوميوسين عن طريق تثبيط Rho1 الداخلي. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لاقتران تعطيل الأكتوميوسين بوساطة Opto-Rho1DN مع الاستئصال بالليزر للتحقيق في دور الأكتوميوسين في توليد التوتر الظهاري أثناء تكوين ثلم ذبابة الفاكهة البطني. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على العديد من العمليات المورفولوجية الأخرى التي تنطوي على انقباض الأكتوميوسين في أجنة ذبابة الفاكهة مع الحد الأدنى من التعديلات. بشكل عام ، تعد هذه الأداة البصرية الجينية نهجا قويا لتشريح وظيفة انقباض الأكتوميوسين في التحكم في ميكانيكا الأنسجة أثناء إعادة تشكيل الأنسجة الديناميكية.

Introduction

انقباض Actomyosin ، قوة الانقباض التي يمارسها الميوسين II غير العضلي (المشار إليه فيما يلي باسم “الميوسين”) على شبكة F-actin ، هي واحدة من أهم القوى في تغيير شكل الخلية ودفع التشكل على مستوى الأنسجة 1,2. على سبيل المثال ، يؤدي تنشيط انقباض الأكتوميوسين في المجال القمي للخلايا الظهارية إلى انقباض قمي ، مما يسهل مجموعة متنوعة من العمليات المورفولوجية ، بما في ذلك الطي الظهاري ، وقذف الخلايا ، والتفريغ ، والتئام الجروح3،4،5،6،7. يتطلب تنشيط الميوسين فسفرة سلسلة الضوء التنظيمية. يخفف هذا التعديل من التشكل المثبط لجزيئات الميوسين ، مما يسمح لها بتكوين حزم خيوط الميوسين ثنائية القطب مع مجالات رأس متعددة على كلا الطرفين. تدفع خيوط الميوسين ثنائية القطب الحركة المضادة للتوازي لخيوط الأكتين وتؤدي إلى توليد قوة انقباضية1،8،9.

تلعب عائلة Rho الصغيرة GTPase RhoA المحفوظة تطوريا (Rho1 في ذبابة الفاكهة) دورا مركزيا في تنشيط انقباض الأكتوميوسين في سياقات خلوية مختلفة10,11. يعمل Rho1 كمفتاح ثنائي الجزيئات عن طريق ربط إما GTP (الشكل النشط) أو الناتج المحلي الإجمالي (الشكل غير النشط)12. يتم تنظيم الدورة بين Rho1 المرتبط ب GTP أو الناتج المحلي الإجمالي من خلال البروتينات المنشطة ل GTPase (GAPs) وعوامل تبادل نيوكليوتيدات الجوانين (GEFs) 13. تعمل GEFs على تسهيل تبادل الناتج المحلي الإجمالي ل GTP وبالتالي تنشيط نشاط Rho1. من ناحية أخرى ، تعمل GAPs على تعزيز نشاط GTPase ل Rho1 وبالتالي إلغاء تنشيط Rho1. يعزز Rho1 المنشط انقباض الأكتوميوسين من خلال التفاعل مع المستجيبات النهائية وتنشيطها ، الكيناز المرتبط ب Rho (Rok) و Diaphanous14. يحث Rok على تنشيط الميوسين وانقباض الأكتوميوسين عن طريق فسفرة سلسلة الضوء التنظيمية للميوسين15. بالإضافة إلى ذلك ، يمنع Rok أيضا الفوسفاتيز المنظم لسلسلة الميوسين الخفيفة ، وبالتالي يعزز تجميع خيوط الميوسين16. يمكن ل Rok أيضا فسفرة كينازات LIM ، والتي ، عند تنشيطها ، تمنع تفكيك الأكتين عن طريق فسفرة وتثبيط عامل إزالة بلمرة الأكتين cofilin17,18. Diaphanous هو نواة الأكتين من عائلة الفورمين التي تعزز بلمرة الأكتين ، مما يوفر قاعدة للميوسين للتفاعل مع19،20،21.

في حين أن الآليات الخلوية التي تنشط انقباض الأكتوميوسين قد تم توضيحها جيدا ، إلا أن فهمنا لوظيفتها في تنظيم إعادة تشكيل الأنسجة الديناميكية لا يزال غير مكتمل. يتطلب سد هذه الفجوة المعرفية مناهج يمكنها تعطيل الأكتوميوسين بسرعة في مناطق أنسجة معينة في الجسم الحي وتسجيل التأثير الفوري على سلوك الأنسجة وخصائصها. يصف هذا البروتوكول استخدام نهج البصريات الوراثي لتثبيط انقباض الأكتوميوسين بشكل حاد أثناء غزو ذبابة الفاكهة الأديم المتوسط ، يليه قياس التوتر الظهاري باستخدام الاستئصال بالليزر. أثناء ذبابة الفاكهة ، تخضع خلايا سلائف الأديم المتوسط الموضعية بطنيا لانقباض قمي وتتسرب من سطح الجنين عن طريق تشكيل ثلم أمامي خلفي22,23. منذ فترة طويلة يستخدم تشكيل الأخاديد البطنية كنموذج لدراسة آلية الطي الظهاري. يتم إعطاء تشكيل الأخدود البطني بواسطة نظام الزخرفة الظهرية البطنية في ذبابة الفاكهة24،25،26،27. يتحكم التعبير عن عاملين للنسخ ، Twist و Snail ، الواقعان في الجانب البطني من الجنين ، في تكوين الأخدود البطني ويحدد مصير خلايا الأديم المتوسط28. يعمل Twist and Snail على تنشيط تجنيد Rho1 GEF RhoGEF2 إلى قمة خلايا سلائف الأديم المتوسط عبر مسار مستقبلات مقترن بالبروتين G وبروتين محول RhoGEF2 ، T4829،30،31،32،33. بعد ذلك ، ينشط RhoGEF2 الميوسين في جميع أنحاء السطح القمي للأديم المتوسط المحتمل من خلال مسار كيناز Rho-Rho34،35،36،37،38،39. يشكل الميوسين المنشط شبكة أكتوميوسين فوق الخلية في جميع أنحاء السطح القمي للأديم المتوسط البدائي ، حيث تؤدي تقلصاتها إلى انقباض قمي وتؤدي إلى زيادة سريعة في توتر الأنسجة القمية14،37،40.

تمنع الأداة البصرية الجينية الموصوفة في هذا البروتوكول ، Opto-Rho1DN ، انقباض الأكتوميوسين من خلال تجنيد غشاء البلازما المعتمد على الضوء الأزرق لشكل سلبي سائد من Rho1 (Rho1DN) 41. تلغي طفرة T19N في Rho1DN قدرة البروتين الطافر على استبدال الناتج المحلي الإجمالي ب GTP وبالتالي تجعل البروتين غير نشط على الدوام34. طفرة لاحقة في Rho1DN ، C189Y ، تقضي على إشارة استهداف الغشاء الساذج42,43. عندما يتم غرس Rho1DN في غشاء البلازما ، فإنه يرتبط ب Rho1 GEFs ويحجزه ، وبالتالي يمنع تنشيط Rho1 وكذلك التنشيط بوساطة Rho1 للميوسين والأكتين34,44. يتم تحقيق توظيف غشاء البلازما ل Rho1DN من خلال وحدة dimerization تعتمد على الضوء مشتقة من Cryptochrome 2 وشريكها الملزم CIB1. Cryptochrome 2 هو مستقبل ضوئي كريبتوكروم نشط بالضوء الأزرق في أرابيدوبسيس ثاليانا45. يرتبط Cryptochrome 2 ب CIB1 ، وهو بروتين حلزوني حلزوني أساسي ، فقط في حالته الضوئية45. وجد لاحقا أن منطقة التماثل الضوئي الطرفية المحفوظة N، من Cryptochrome 2 (CRY2PHR، المشار إليها فيما يلي باسم CRY2) والمجال N-terminal (aa 1-170) من CIB1 (المشار إليها فيما يلي باسم CIBN) مهمة للإزالة المستحثة بالضوء46. يحتوي Opto-Rho1DN على مكونين. المكون الأول هو بروتين CIBN المنصهر مع مرساة CAAX ، والتي تحدد موقع البروتين إلى غشاء البلازما47. المكون الثاني هو CRY2 الموسوم ب mCherry المنصهر مع Rho1DN41. في غياب الضوء الأزرق ، يبقى CRY2-Rho1DN في السيتوبلازم. عند تحفيز الضوء الأزرق ، يتم استهداف CRY2-Rho1DN لغشاء البلازما من خلال التفاعل بين CIBN المرتبط بالغشاء و CRY2 المثار. يمكن تنشيط Opto-Rho1DN عن طريق الأشعة فوق البنفسجية A (UVA) والضوء الأزرق (400-500 نانومتر ، ذروة التنشيط عند 450-488 نانومتر) ، أو بواسطة ليزر نابض 830-980 نانومتر عند إجراء تحفيز ثنائي الفوتون41،46،47،48. لذلك ، يتم تحفيز Opto-Rho1DN بواسطة الأطوال الموجية المستخدمة عادة ل GFP المثير (488 نانومتر لتصوير الفوتون الفردي و 920 نانومتر للتصوير ثنائي الفوتون). في المقابل ، فإن الأطوال الموجية المستخدمة بشكل شائع في mCherry المثير (561 نانومتر لتصوير الفوتون الفردي و 1040 نانومتر للتصوير ثنائي الفوتون) لا تحفز وحدة البصريات الوراثية وبالتالي يمكن استخدامها للتصوير المسبق للتحفيز. يصف البروتوكول الأساليب المستخدمة لتقليل مخاطر التحفيز غير المرغوب فيه أثناء معالجة العينة.

تم استخدام الاستئصال بالليزر على نطاق واسع للكشف عن التوتر في الخلايا والأنسجةوقياسه 49. أظهرت الدراسات السابقة أنه عندما يتم التحكم في شدة الليزر بشكل مناسب ، فإن الاجتثاث بالليزر ثنائي الفوتون الذي يستخدم ليزر الفيمتو ثانية القريب من الأشعة تحت الحمراء يمكن أن يضعف جسديا بعض الهياكل تحت الخلوية (على سبيل المثال ، شبكات الأكتوميوسين القشرية) دون التسبب في نشوة غشاء البلازما50,51. إذا كان النسيج تحت التوتر ، فإن الاستئصال بالليزر لمنطقة ذات أهمية داخل الأنسجة يؤدي إلى ارتداد خارجي فوري للخلايا المجاورة للمنطقة المستأصلة. سرعة الارتداد هي دالة لحجم التوتر ولزوجة الوسائط (السيتوبلازم) المحيطة بالهياكل التي تخضع للارتداد49. نظرا لعمق الاختراق الفائق لليزر القريب من الأشعة تحت الحمراء والقدرة على تحقيق الاستئصال البؤري المحصور جيدا ، فإن الاستئصال بالليزر ثنائي الفوتون مفيد بشكل خاص للكشف عن توتر الأنسجة في الجسم الحي. كما هو موضح في هذا البروتوكول ، يمكن دمج هذه الطريقة بسهولة مع تعطيل انقباض الأكتوميوسين بوساطة Opto-Rho1DN للتحقيق في التأثير المباشر للانقباض الخلوي المعتمد على Rho1 على ميكانيكا الأنسجة أثناء إعادة تشكيل الأنسجة الديناميكية.

Protocol

1. إعداد الصليب الجيني وإعداد كوب جمع البويضات حدد الذباب الأنثوي (العذراء) من الخط البصري الوراثي UASp-CIBNpm (I) ؛ UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) على وسادة CO2 تحت المجهر المجسم وإعداد صليب مع الذباب الذكور من خط سائق الأم GAL4 67 Sqh-mCherry ؛ 15 E-cadherin-GFP.ملاحظة: يرمز 67 و 15 إلى الأم توبولين GAL4 الذي ت…

Representative Results

في الأجنة غير المحفزة التي تخضع للانقباض القمي ، أصبح Sqh-mCherry غنيا في المنطقة القمية المتوسطة لخلايا الأديم المتوسط البطني ، بينما كان CRY2-Rho1DN-mCherry خلويا (الشكل 1 أ). أدى الاجتثاث بالليزر داخل مجال الانقباض إلى ارتداد سريع للأنسجة على طول محور A-P (الشكل 1B ، C…

Discussion

وصف هذا البروتوكول الاستخدام المشترك لعلم البصريات الوراثي والاستئصال بالليزر لاستكشاف التغيرات في توتر الأنسجة مباشرة بعد تعطيل انقباض الأكتوميوسين. تستفيد الأداة البصرية الوراثية الموصوفة هنا من الشكل السلبي السائد ل Rho1 (Rho1DN) لتثبيط انقباض الأكتوميوسين الداخلي المنشأ Rho1 و Rho1 بشكل حا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون آن لافانواي على دعم التصوير. يشكر المؤلفون مختبر Wieschaus ومختبر De Renzis لمشاركة الكواشف ومركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة لمخزون الذباب. هذه الدراسة مدعومة من قبل NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 ومنحة البحوث المؤسسية لجمعية السرطان الأمريكية #IRG-82-003-33 إلى BH.

Materials

35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. 발생학. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. 유전학. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -. A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -. M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Tags

OptogeneticsActomyosin ContractilityEpithelial TensionDrosophila EmbryosLaser AblationMechanical ForcesCell MechanicsCell Sheet FoldingApical Constriction
check_url/kr/65314?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image