Inibição Optogenética da Contratilidade da Actomiosina Mediada por Rho1 Juntamente com a Medida da Tensão Epitelial em Embriões de Drosophila

Summary

A contratilidade da actomiosina desempenha um papel importante na morfogênese celular e tecidual. No entanto, é um desafio manipular agudamente a contratilidade da actomiosina in vivo . Este protocolo descreve um sistema optogenético que inibe rapidamente a contratilidade da actomiosina mediada por Rho1 em embriões de Drosophila , revelando a perda imediata da tensão epitelial após a inativação da actomiosina in vivo.

Abstract

As forças contráteis geradas pela actina e pela miosina não muscular II (“contratilidade da actomiosina”) são críticas para alterações morfológicas de células e tecidos em múltiplas escalas de comprimento, tais como divisão celular, migração celular, dobramento epitelial e morfogênese ramificada. Uma compreensão profunda do papel da contratilidade da actomiosina na morfogênese requer abordagens que permitam a rápida inativação da actomiosina, o que é difícil de ser alcançado usando abordagens genéticas ou farmacológicas convencionais. O protocolo apresentado demonstra o uso de um sistema de dimerização optogenética baseado em CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, para inibir a contratilidade da actomiosina em embriões de Drosophila com controles temporais e espaciais precisos. Neste sistema, CRY2 é fundido à forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN), enquanto CIBN é ancorado à membrana plasmática. A dimerização mediada pela luz azul de CRY2 e CIBN resulta em rápida translocação de Rho1DN do citoplasma para a membrana plasmática, onde inativa a actomiosina inibindo Rho1 endógeno. Além disso, este artigo apresenta um protocolo detalhado para acoplamento da inativação da actomiosina mediada por Opto-Rho1DN com ablação a laser para investigar o papel da actomiosina na geração de tensão epitelial durante a formação do sulco ventral de Drosophila . Este protocolo pode ser aplicado a muitos outros processos morfológicos que envolvem a contratilidade da actomiosina em embriões de Drosophila com modificações mínimas. Em geral, esta ferramenta optogenética é uma abordagem poderosa para dissecar a função da contratilidade da actomiosina no controle da mecânica tecidual durante o remodelamento dinâmico tecidual.

Introduction

A contratilidade da actomiosina, força contrátil exercida pela miosina II não muscular (doravante denominada “miosina”) sobre a rede de actina-F, é uma das forças mais importantes na mudança da forma celular e na condução da morfogênese tecidual ^1,2. Por exemplo, a ativação da contratilidade da actomiosina no domínio apical das células epiteliais resulta em constrição apical, o que facilita uma variedade de processos morfogenéticos, incluindo dobramento epitelial, extrusão celular, delaminação e cicatrização de feridas 3,4,5,6,7 . A ativação da miosina requer a fosforilação de sua cadeia leve reguladora. Essa modificação alivia a conformação inibitória das moléculas de miosina, permitindo que elas formem feixes filamentares de miosina bipolar com múltiplos domínios de cabeça em ambas as extremidades. Os filamentos bipolares de miosina conduzem o movimento antiparalelo dos filamentos de actina e resultam na geração de força contrátil ^1,8,9.

A pequena GTPase RhoA (Rho1 em Drosophila) conservada evolutivamente desempenha um papel central na ativação da contratilidade da actomiosina em vários contextos celulares^10,11. Rho1 funciona como um interruptor bimolecular, ligando-se a GTP (forma ativa) ou GDP (forma inativa)¹². A ciclagem entre Rho1 ligado ao GTP ou GDP-bound é regulada por suas proteínas ativadoras de GTPase (GAPs) e fatores de troca de nucleotídeos guanina (GEFs)¹³. Os GEFs funcionam para facilitar a troca de PIB por GTP e, assim, ativar a atividade Rho1. Os GAPs, por outro lado, aumentam a atividade GTPase de Rho1 e, assim, desativam Rho1. O Rho1 ativado promove a contratilidade da actomiosina interagindo e ativando seus efetores a jusante, a quinase associada ao Rho (Rok) e a diáfana¹⁴. Rok induz a ativação da miosina e a contratilidade da actomiosina fosforilando a cadeia leve reguladora da miosina¹⁵. Além disso, Rok também inibe a fosfatase de cadeia leve reguladora da miosina e, portanto, promove ainda mais a montagem do filamento de miosina¹⁶. Rok também pode fosforilar LIM quinases, que, quando ativadas, impedem a desmontagem da actina fosforilando e inibindo o fator de despolimerização da actina^{cofilina 17,18}. O diáfano é um nucleador de actina da família das forminas que promove a polimerização da actina, fornecendo uma base para a miosina interagir com 19,20,21.

Embora os mecanismos celulares que ativam a contratilidade da actomiosina tenham sido bem elucidados, nossa compreensão de sua função na regulação do remodelamento dinâmico tecidual permanece incompleta. O preenchimento dessa lacuna de conhecimento requer abordagens que possam inativar rapidamente a actomiosina em regiões específicas do tecido in vivo e registrar o impacto imediato no comportamento e nas propriedades teciduais. Este protocolo descreve o uso de uma abordagem optogenética para inibir agudamente a contratilidade da actomiosina durante a invaginação do mesoderma de Drosophila, seguida de medição da tensão epitelial usando ablação a laser. Durante a gastrulação de Drosophila, as células precursoras do mesoderma localizadas ventralmente sofrem constrição apical e invaginam a partir da superfície do embrião, formando um sulco orientado anteroposterior^22,23. A formação de sulcos ventrais tem sido utilizada há muito tempo como modelo para o estudo do mecanismo de dobramento epitelial. A formação do sulco ventral é administrada pelo sistema de padronização dorso-ventral em Drosophila^24,25,26,27. A expressão de dois fatores de transcrição, Twist e Snail, localizados na face ventral do embrião, controla a formação do sulco ventral e especifica o destino das células mesodérmicas²⁸. Twist e Snail ativam o recrutamento do Rho1 GEF RhoGEF2 para o ápice das células precursoras do mesoderma através de uma via de receptor acoplado à proteína G e uma proteína adaptadora RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. Em seguida, o RhoGEF2 ativa a miosina em toda a superfície apical do mesoderma potencial através da via Rho-Rho quinase 34,35,36,37,38,39. A miosina ativada forma uma rede supracelular de actomiosina em toda a superfície apical do mesoderma primórdio, cujas contrações conduzem a constrição apical e resultam em rápido aumento da tensão tecidual apical14,37,40.

A ferramenta optogenética descrita neste protocolo, Opto-Rho1DN, inibe a contratilidade da actomiosina através do recrutamento da membrana plasmática dependente de luz azul de uma forma dominante negativa de Rho1 (Rho1DN)⁴¹. Uma mutação T19N em Rho1DN elimina a capacidade da proteína mutante de trocar GDP por GTP e, assim, torna a proteína perpetuamente inativa³⁴. Uma mutação subsequente em Rho1DN, C189Y, elimina seu sinal de direcionamento de membrana virgens^42,43. Quando Rho1DN é infundido à membrana plasmática, ele se liga e retém Rho1 GEFs, bloqueando assim a ativação de Rho1, bem como a ativação de miosina e actina mediada por Rho1^34,44. O recrutamento da membrana plasmática de Rho1DN é obtido através de um módulo de dimerização dependente de luz derivado do Cryptochrome 2 e seu parceiro de ligação CIB1. O criptocromo 2 é um fotorreceptor de criptocromo ativado pela luz azul em Arabidopsis thaliana⁴⁵. O criptocromo 2 liga-se à CIB1, uma proteína básica hélice-alça-hélice, apenas em seu estado fotoexcitado⁴⁵. Posteriormente, verificou-se que a região conservada N-terminal, fotoliase homologia (PHR), do Criptocromo 2 (CRY2_PHR, doravante denominada CRY2) e o domínio N-terminal (aa 1-170) do CIB1 (doravante CIBN) são importantes para a dimerização induzida pela luz⁴⁶. Opto-Rho1DN contém dois componentes. O primeiro componente é a proteína CIBN fusionada com uma âncora CAAX, que localiza a proteína na membrana plasmática⁴⁷. O segundo componente é o mCherry-tagged CRY2 fundido com Rho1DN⁴¹. Na ausência de luz azul, CRY2-Rho1DN permanece no citoplasma. Após a estimulação com luz azul, o CRY2-Rho1DN é direcionado para a membrana plasmática através da interação entre CIBN ancorado na membrana e CRY2 excitado. Opto-Rho1DN pode ser ativado por luz ultravioleta A (UVA) e luz azul (400-500 nm, pico de ativação em 450-488 nm), ou por um laser pulsado de 830-980 nm ao realizar estimulação de dois fótons^41,46,47,48. Portanto, Opto-Rho1DN é estimulado por comprimentos de onda normalmente usados para excitar GFP (488 nm para imagens de fóton único e 920 nm para imagens de dois fótons). Em contraste, comprimentos de onda comumente usados para excitar mCherry (561 nm para imagens de fóton único e 1.040 nm para imagens de dois fótons) não estimulam o módulo optogenético e, portanto, podem ser usados para imagens de pré-estimulação. O protocolo descreve as abordagens utilizadas para minimizar o risco de estimulação indesejada durante a manipulação da amostra.

A ablação a laser tem sido extensivamente empregada para detectar e medir a tensão em células e tecidos⁴⁹. Estudos anteriores mostraram que, quando a intensidade do laser é adequadamente controlada, a ablação com laser de dois fótons empregando um laser infravermelho próximo de femtossegundo pode prejudicar fisicamente algumas estruturas subcelulares (por exemplo, redes de actomiosina cortical) sem causar arrebatamento da membrana plasmática^50,51. Se o tecido estiver sob tensão, a ablação a laser de uma região de interesse dentro do tecido resulta em um recuo externo imediato das células adjacentes à região ablada. A velocidade de recuo é função da magnitude da tensão e da viscosidade do meio (citoplasma) que circunda as estruturas submetidas ao recuo⁴⁹. Devido à profundidade de penetração superior dos lasers de infravermelho próximo e à capacidade de alcançar uma ablação focal bem confinada, a ablação a laser de dois fótons é particularmente útil para detectar tensão tecidual in vivo. Como demonstrado neste protocolo, este método pode ser facilmente combinado com a inativação da contratilidade da actomiosina mediada por Opto-Rho1DN para investigar o impacto direto da contratilidade celular Rho1-dependente na mecânica tecidual durante a remodelação dinâmica tecidual.

Protocol

1. Montagem do cruzamento genético e preparo do copo de coleta de óvulos Selecionar moscas fêmeas (virgens) da linhagem optogenética UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) em uma almofada de CO2 sob um estereomicroscópio e montou um cruzamento com moscas machos da linha de driver GAL4 materna 67 Sqh-mCherry; 15 E-caderina-GFP.NOTA: O 67 e o 15 significam GAL4 maternal-tubulina inserida no segundo (II) e terceiro (III) cromossomos, respectivamente52…

Representative Results

Nos embriões não estimulados submetidos à constrição apical, o Sqh-mCherry enriqueceu-se na região medioapical das células mesodérmicas ventrais, enquanto o CRY2-Rho1DN-mCherry foi citosólico (Figura 1A). A ablação a laser dentro do domínio de constrição levou a um rápido recuo tecidual ao longo do eixo A-P (Figura 1B,C). Nos embriões estimulados, o sinal CRY2-Rho1DN-mCherry tornou-se localizado na membrana plasmática, enquanto …

Discussion

Este protocolo descreveu o uso combinado de optogenética e ablação a laser para sondar mudanças na tensão tecidual imediatamente após a inativação da contratilidade da actomiosina. A ferramenta optogenética aqui descrita aproveita a forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN) para inibir agudamente a contratilidade endógena de Rho1 e actomiosina dependente de Rho1. A caracterização prévia do Opto-Rho1DN no contexto da formação do sulco ventral de Drosophila demonstrou que a ferramenta é altamente e…

Materials

35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation