Summary
유전자 발현은 유전자 프로모터와 원위 조절 요소의 상호작용에 의해 조절된다. 여기서는 낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 통해 이전에는 측정할 수 없었던 희귀 세포 유형에서 이러한 상호 작용을 식별할 수 있는 방법을 설명합니다.
Abstract
시공간 유전자 전사는 전사를 제어하기 위해 표적 유전자 프로모터와의 물리적 근접성에 의존하는 인핸서 및 소음기와 같은 원위 조절 요소에 의해 엄격하게 조절됩니다. 이러한 조절 요소는 식별하기 쉽지만 대부분이 세포 유형에 특이적이며 선형 게놈 서열에서 수백 킬로베이스로 분리되어 다른 비표적 유전자를 건너뛰기 때문에 표적 유전자를 예측하기 어렵습니다. 수년 동안 Promoter Capture Hi-C(PCHi-C)는 원위 조절 요소를 표적 유전자에 결합시키는 데 있어 황금 표준이었습니다. 그러나 PCHi-C는 수백만 개의 세포 가용성에 의존하여 일차 조직에서 일반적으로 얻은 것과 같은 희귀 세포 집단에 대한 연구를 금지합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 게놈의 각 유전자를 제어하는 원위 조절 요소의 레퍼토리를 식별하는 비용 효율적이고 맞춤형 방법인 저입력 Capture Hi-C(liCHi-C)가 개발되었습니다. liCHi-C는 PCHi-C와 유사한 실험 및 계산 프레임워크에 의존하지만 최소한의 튜브 변경을 사용하고 시약 농도 및 부피를 수정하고 단계를 바꾸거나 제거함으로써 라이브러리 구성 중 재료 손실을 최소화합니다. 총체적으로, liCHi-C는 발달 생물학 및 세포 기능의 맥락에서 유전자 조절 및 시공간 게놈 조직의 연구를 가능하게 합니다.
Introduction
시간적 유전자 발현은 세포 분화와 궁극적으로 유기체 발달을 유도하며, 그 변화는 광범위한 질병 1,2,3,4,5와 밀접한 관련이 있습니다. 유전자 전사는 조절 요소의 작용에 의해 미세하게 조절되며, 이는 근위부(즉, 유전자 프로모터) 및 원위부(예: 인핸서 또는 소음기)로 분류될 수 있으며, 후자는 종종 표적 유전자로부터 멀리 떨어져 있고 유전자 발현을 조절하기 위해 염색질 루핑을 통해 물리적으로 상호작용합니다 6,7,8.
게놈에서 원위 조절 영역의 식별은 널리 합의된 문제인데, 이 영역은 특정 히스톤 변형 9,10,11을 포함하고 특정 전사 인자 인식 모티프를 포함하여 이들에 대한 모집 플랫폼 역할을 하기 때문입니다(12,13,14). 게다가, 인핸서(enhancers)와 수퍼-인핸서(super-enhancer)15,16의 경우, 이들은 또한 낮은 뉴클레오솜 점유(low-nucleosome occupancy)17,18를 가지며, 비-코딩 eRNAs(non-coding eRNA)로 전사된다(19,20).
그럼에도 불구하고 각 원위 조절 요소의 표적 유전자는 예측하기가 더 어렵습니다. 종종 원위 조절 요소와 표적 사이의 상호 작용은 세포 유형 및 자극 특이적이며21,22, 수백 킬로베이스에 걸쳐 있으며, 어떤 방향으로든 다른 유전자를 연결하고23,24,25 표적 유전자 또는 다른 비개입 유전자의 인트로닉 영역 내부에 위치할 수도 있습니다26,27. 또한, 원위 조절 요소는 동시에 하나 이상의 유전자를 제어 할 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다28,29. 이러한 위치 복잡성은 이들 사이의 조절 연관성을 정확히 찾아내는 것을 방해하므로 모든 세포 유형에서 각 조절 요소의 표적 대부분은 알려지지 않은 상태로 남아 있습니다.
최근 몇 년 동안 염색질 상호작용을 연구하기 위한 염색체 형태 포획(3C) 기술의 개발이 크게 붐을 일으켰습니다. 그 중 가장 널리 사용되는 Hi-C는 세포 게놈30의 모든 단편 사이의 모든 상호 작용에 대한 지도를 생성할 수 있습니다. 그러나 제한 단편 수준에서 중요한 상호 작용을 감지하기 위해 Hi-C는 초심층 시퀀싱에 의존하여 개별 유전자의 조절 환경을 일상적으로 연구하는 데 사용하는 것을 금지합니다. 이러한 경제적 한계를 극복하기 위해 ChIA-PET31, HiChIP 32 및 저투입 대응 HiCuT 33과 같은 여러 농축 기반3C 기술이 등장했습니다. 이러한 기술은 특정 단백질에 의해 매개되는 게놈 차원의 상호작용을 풍부하게 하기 위한 항체의 사용에 의존한다. 그럼에도 불구하고 이러한 3C 기술의 고유한 기능은 응용 프로그램의 골칫거리이기도 합니다. 사용자는 관심 단백질에 대한 고품질 항체의 가용성에 의존하며 단백질의 결합이 동적인 조건을 비교할 수 없습니다.
프로모터 캡쳐 Hi-C(PCHi-C)는 이러한 제한(34,35)을 우회하는 또 다른 농축 기반3C 기술이다. PCHi-C는 비오티닐화 RNA 프로브 농축 시스템을 사용하여 28,650개의 인간 또는 27,595개의 마우스 주석이 달린 유전자 프로모터(프로모터 상호작용이라고도 함)와 상호 작용하는 게놈 영역의 게놈 전체 고해상도 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하면 활성 및 비활성 프로모터 모두의 제한 단편 수준 분해능에서 중요한 장거리 상호작용을 검출할 수 있으며, 히스톤 변형 또는 단백질 결합의 역학과 독립적으로 모든 조건 간의 프로모터 상호작용을 강력하게 비교할 수 있습니다. PCHi-C는 세포 분화 동안 프로모터 상호작용체 재구성을 확인하고(36,37), 전사 인자(38,39)의 작용 메커니즘을 확인하고, 비암호화 변이체(40,41,42,43,44,45)에 의해 질병에서 조절되지 않는 새로운 잠재적 유전자 및 경로를 발견하기 위해 최근 몇 년 동안 널리 사용되어 왔다.46,47,48, 새로운 드라이버 비암호화 돌연변이49,50과 함께. 게다가, 단지 포획 시스템을 수정함으로써, 이 기술은 임의의 상호작용체(예를 들어, 인핸서 상호작용체(51) 또는 비-코딩 변경들의 집합체의 상호작용체(41, 52))를 조사하기 위해 생물학적 질문에 따라 맞춤화될 수 있다.
그러나 PCHi-C는 이 기술을 수행하기 위해 최소 2천만 개의 세포에 의존하므로 발달 생물학 및 임상 응용 분야에서 자주 사용되는 것과 같은 희소한 세포 집단에 대한 연구를 방해합니다. 이러한 이유로 우리는 낮은 셀 입력으로 고분해능 프로모터 상호 작용을 생성하기 위해 PCHi-C의 실험적 프레임워크를 기반으로 하는 새로운 비용 효율적이고 사용자 정의 가능한 방법인 저입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 개발했습니다. 최소한의 튜브 변경으로 실험을 수행하고, 원래의 PCHi-C 프로토콜에서 단계를 바꾸거나 제거하고, 반응 부피를 대폭 줄이고, 시약 농도를 수정함으로써 라이브러리 복잡성이 극대화되고 50,000개 이상의 세포로 고품질 라이브러리를 생성할 수 있습니다53.
낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)는 PCHi-C에 대해 벤치마킹되었으며 인간 조혈 세포 분화 동안 프로모터 상호작용 재배선을 밝히고, 비코딩 변경에 의해 조절되지 않는 잠재적인 새로운 질병 관련 유전자 및 경로를 발견하고, 염색체 이상을 감지하는 데 사용됩니다53. 단계별 프로토콜과 기술을 통한 다양한 품질 관리는 라이브러리의 최종 생성 및 계산 분석까지 여기에 자세히 설명되어 있습니다.
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Protocol
재료 손실을 최소화하기 위해 (1) DNA 저결합 튜브 및 팁으로 작업하고( 재료 표 참조), (2) 샘플 내부에 팁을 삽입하는 대신 튜브 벽에 시약을 배치하고, (3) 가능하면 샘플을 위아래로 피펫팅하는 대신 반전으로 샘플을 혼합하고, 나중에 스핀다운하여 샘플을 회수합니다.
1. 세포 고정
- 현탁액에서 자라는 세포
- 50,000개에서 100만 개의 세포를 채취하여 DNA 저결합 1.5mL 튜브에 넣습니다.
참고: 본 연구에 사용된 세포 유형은 대표 결과 섹션에 자세히 설명되어 있습니다. - 고정각 로터 원심분리기를 사용하여 세포를 600 x g (4°C에서)에서 5분 동안 원심분리하고, 피펫팅에 의해 상청액을 제거하였다.
- 실온에서 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 RPMI 1640 1mL에 세포를 재현탁합니다.
- 143 μL의 메탄올이없는 16 % 포름 알데히드를 첨가하여 2 %의 농도에 도달하고 혼합합니다.
- 세포를 고정하기 위해 실온에서 회전하면서 10분 동안 세포를 배양합니다.
알림: 10분 배양으로 가능한 한 정확하도록 노력하십시오. 세포의 과잉 또는 과소 고정은 라이브러리의 품질을 저하시킬 수 있습니다. - 얼음처럼 차가운 1M 글리신 164μL를 첨가하여 반응을 소멸시키고 혼합합니다. 실온에서 회전하면서 5분 동안 세포를 배양합니다.
- 얼음 위에서 15분 동안 세포를 더 배양하고 ~5분마다 반전하여 혼합합니다.
- 고정각 로터 원심분리기를 사용하여 세포를 1,000 x g (4°C에서)에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다.
- 펠릿을 얼음처럼 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL에 재현탁하여 세포를 세척합니다.
- 세포를 1,000 x g (4°C에서)에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다.
알림: 펠렛 세포는 액체 질소 또는 드라이 아이스에서 급속 냉동하고 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
- 50,000개에서 100만 개의 세포를 채취하여 DNA 저결합 1.5mL 튜브에 넣습니다.
- 부착 세포
- 배양 접시에서 세포를 1x PBS로 세척합니다.
- 배양 접시를 덮을 수 있도록 실온에서 10% FBS 및 메탄올이 없는 2% 포름알데히드로 보충된 RPMI 1640을 충분히 준비합니다.
- 보충된 배지를 세포와 함께 배양 접시에 넣고 실온에서 흔들어 세포를 고정시키면서 10분 동안 배양합니다.
알림: 10분 배양으로 가능한 한 정확하도록 노력하십시오. 세포의 과잉 또는 과소 고정은 라이브러리의 품질을 저하시킬 수 있습니다. - 0.125 M이 될 때까지 1 M 글리신을 첨가하여 반응을 소멸시키고 흔들어서 혼합한다.
- 실온에서 흔들면서 5분 동안 세포를 배양합니다.
- 세포를 4°C에서 15분 동안 추가로 인큐베이션하고, 3-4분마다 흔들면서 혼합한다.
- 배지를 제거하고 차가운 1x PBS로 세포를 세척합니다.
- 세포를 긁어내어 1.5mL DNA 저결합 튜브에 옮깁니다. 0.5-1mL의 차가운 1x PBS로 배양 접시를 깨끗이 닦습니다.
- 고정각 로터 원심분리기를 사용하여 세포를 1,000 x g (4°C에서)에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다. 펠렛화된 셀은 액체 질소 또는 드라이아이스에서 급속 냉동하고 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 용해 및 소화
- 세포를 1mL의 저온 용해 완충액(표 1)에 재현탁하여 세포막을 파괴합니다. 완충액의 첨가만으로도 세포를 재현탁시키기에 충분해야 하지만, 필요한 경우 가벼운 와동에 의해 세포를 추가로 재현탁할 수 있습니다.
- 얼음에서 30분 동안 배양하고 ~5분마다 반전하여 혼합합니다. 핵을 1,000 x g (4°C에서)에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 500μL의 차가운 1.25x 제한 완충액 2로 핵을 재현탁합니다( 재료 표 참조).
- 핵을 1,000 x g (4°C에서)에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 1.25x 제한 버퍼 2의 179μL에 핵을 재현탁합니다.
- 5.5 μL의 10% 소듐 도데실 설페이트(SDS; 표 참조) 를 넣고 혼합합니다. 세포는 덩어리를 형성 할 수 있습니다. 이는 정상이며 소용돌이를 통해 최대한 분해해야 합니다. 샘플을 950 rpm에서 진탕하면서 thermoblock에서 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션합니다.
- 37.5 μL의 10% Triton X-100을 첨가하여 SDS를 소멸시키고 혼합합니다. 샘플을 950 rpm에서 진탕하면서 thermoblock에서 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션합니다.
- 7.5 μL의 HindIII (100 U / μL, 재료 표 참조)를 추가하여 염색질을 분해하고 혼합합니다. 샘플을 37°C에서 하룻밤 동안 thermoblock에서 950rpm으로 진탕하면서 배양합니다.
- 다음날 아침, HindIII 2.5μL(100U/μL)를 추가로 추가하고 적절한 염색질 소화를 위해 950rpm으로 진탕하면서 37°C에서 1시간 동안 샘플을 더 배양합니다.
알림: 소화 효율 조절의 일환으로(5.1단계 참조), 20,000에서 40,000 핵에 해당하는 핵을 다른 튜브로 옮겨 소화되지 않은 대조군을 나타냅니다. 소화 후 동일한 수의 세포를 다시 다른 튜브로 옮겨 소화된 대조군을 나타냅니다. 출발 물질의 가용성이 부족한 경우 별도의 실험으로 소화 효율을 테스트하는 것이 좋습니다.
3. 결찰 및 탈가교
- 샘플을 얼음 위에서 식히십시오. 마스터믹스를 준비하고 다음 시약을 첨가하여 제한 단편 오버행을 채우고 비오틴화합니다: 3 μL의 10x 제한 완충액 2, 1 μL의 뉴클레아제가 없는 물, 0.75 μL의 10 mM dCTP, 0.75 μL의 10 mM dTTP, 0.75 μL의 10 mM dGTP, 18.75 μL의 0.4 mM 비오틴-14-dATP, 5 μL의 5 U/μL Klenow( 재료 표 참조). 37°C에서 75분 동안 샘플을 배양하고 ~15분마다 반전하여 혼합합니다.
- 샘플을 얼음 위에서 식히십시오. 마스터믹스를 준비하고 다음 시약을 추가하여 채워진 DNA 말단을 결찰합니다: 50μL의 10x 결찰 완충액, 2.5μL의 20mg/mL 소 혈청 알부민(BSA), 12.5μL의 1U/μL T4 DNA 리가제 및 173μL의 뉴클레아제가 없는 물( 재료 표 참조).
- 샘플을 16°C에서 4-6시간 동안 배양하고 ~1시간마다 반전하여 혼합합니다. 또한, 샘플을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 30 μL의 10 mg/mL Proteinase K를 첨가하여 염색질을 가교 결합시키고 혼합합니다. 샘플을 65°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 다음날 아침, 10mg/mL 프로테이나제 K 15μL를 추가로 추가하고 적절한 염색질 가교결합을 보장하기 위해 65°C에서 2시간 동안 샘플을 추가로 배양합니다.
4. DNA 정제
- 샘플을 실온으로 냉각하고 페놀-클로로포름 정제에 적합한 튜브로 옮깁니다.
- 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1)의 1 부피 (545 μL)를 첨가하여 DNA를 정제하고 격렬하게 흔들어 혼합합니다.
- 실온에서 12,000 x g 에서 5분 동안 샘플을 원심분리하고 상부 수성상(545μL)을 2mL DNA 저결합 튜브로 옮깁니다.
- DNA를 침전시키기 위해 다음 시약을 첨가하십시오: -20°C로 냉각된 100% 에탄올 1,362.5μL, 3M 아세트산나트륨(pH 5.2) 54.5μL, 공침전제로 15mg/mL 글리코겐 2μL.
- -80°C에서 1시간 동안 또는 -20°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 샘플을 4°C에서 16,000-21,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다. DNA 펠릿이 보여야 합니다.
- 70% 에탄올 1mL를 첨가하고, 볼텍싱하고, 실온에서 16,000-21,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 세척한다.
- 상층액을 제거하고 펠릿을 자연 건조시킵니다. 뉴클레아제가 없는 물 130μL에 DNA 펠릿을 재현탁합니다.
- 형광 정량화로 농도를 평가합니다( 재료 표 참조). 정제된 3C 물질을 프로토콜을 진행하기 전에 수개월 동안 -20°C에서 보관한다.
5. 선택적인 품질 관리
- 소화 효율을 평가하십시오. 앞서 설명한 대로 2.13단계에서 얻은 소화되지 않고 소화된 대조군에 대해 역가교 및 페놀:클로로포름 DNA 정제를 수행합니다. 뉴클레아제가 없는 물 10μL에 DNA 펠릿을 재현탁합니다. 농도를 정량화하고 필요한 경우 얻은 DNA를 4ng/μL로 희석합니다.
- HindIII 표적이 있거나 없는 개방형 염색질 유전자좌에 걸쳐 있는 프라이머를 사용하여 소화되지 않은 대조군과 소화된 대조군 모두의 DNA 4ng으로 정량적 PCR을 수행합니다(프라이머 설계는 표 2 참조). 이전에 발표 된 보고서35에 따라 소화 효율을 계산하십시오.
참고: 결찰 효율은 다음 공식을 사용하여 백분율로 계산됩니다: 소화(%) = 100 -100/(2^[(HindIII로 분해된 Ct - HindIII 없이 소화된 Ct) - (HindIII로 소화되지 않은 Ct - HindIII 없이 소화되지 않은 Ct)]) (표 3 참조), 소화되지 않은 대조군과 소화된 대조군에서 각 프라이머 쌍에 대해 얻은 서로 다른 Cts의 차이를 고려합니다. - 기존 중합효소 연쇄 반응(PCR)(0.2mM dNTP, 0.4μm F + R 프라이머 모두, 0.1 및 U/μL 핫 스타트 중합효소)을 수행하여 상호 작용 검출의 민감도를 평가합니다. 50-100ng의 3C 물질(각각 단거리 및 장거리 상호작용용)을 사용하고 다음 조건을 사용하여 증폭합니다: 98°C에서 15분, 98°C에서 30초, 60°C에서 1분, 72°C에서 1분, 72°C에서 10분 동안 마무리합니다. 4 °C에서 유지하십시오.
참고: 얻은 DNA의 양이 2μg 미만인 경우 전체 상호 작용 패널 대신 장거리 및 단거리 상호 작용만 확인하십시오. - 1.6% 아가로스 겔을 사용하여 1x 트리스-보레이트-EDTA(TBE)에서 제품을 실행하고 해당 PCR 앰플리콘54의 존재를 찾습니다.
참고: 게놈의 예측할 수 없는 "잘라내기 및 붙여넣기"로 인해 비특이적 밴드가 나타날 수 있습니다. 올바른 밴드 크기가 관찰되는 한 올바른 것으로 계산됩니다. - 단거리 PCR 산물을 HindIII, NheI( 재료 표 참조), 효소 또는 없음(물)으로 차등적으로 분해하고 1x TBE 1.6% 아가로스 겔에서 산물을 실행하여 비오틴 충전 및 결찰의 효율성을 평가합니다. 올바른 충전 및 결찰은 이전 HindIII 표적을 제거하고 새로운 NheI 표적을 생성하므로 앰플리콘은 NheI가 있는 경우에만 절단해야 합니다.
참고: 재료 손실을 최소화하려면 상호 작용 대조군에서 단거리 PCR 산물 2.5μL를 검색하고 재증폭하여 5회 주입하여 충전 및 결찰 제어를 수행합니다.
6. 초음파 처리
- 130 μL의 샘플 (일부가 대조군에 사용 된 경우 뉴 클레아제가없는 물로 채우기)을 초음파 처리에 적합한 큐벳으로 옮깁니다.
- 수조 초음파 처리기를 설정하고 다음 매개 변수를 사용하여 초음파 처리합니다 ( 재료 표에 설명 된 모델 및 큐벳에 최적화 됨) : 듀티 팩터 : 20 %; 피크 입사 전력 : 50; 버스트당 사이클: 200; 시간 : 65 초; 및 온도 범위: 6-10°C(8°C 최적).
- 샘플을 새로운 1.5mL DNA 저결합 튜브로 옮깁니다.
7. 최종 수리
- 마스터 믹스를 준비하고 초음파 처리 중에 생성 된 DNA 단편의 고르지 않은 끝을 복구하기 위해 다음 시약을 추가하십시오 : 18 μL의 10x 결찰 완충액, 18 μL의 2.5 mM dNTP 믹스, 6.5 μL의 3 U / μL T4 DNA 중합 효소, 6.5 μL의 10 U / μL T4 PNK 및 1.3 μL의 5 U / μL Klenow ( 재료 표 참조).
- 샘플을 20°C에서 30분 동안 인큐베이션하고 300 μL로 Tris-low EDTA (TLE) 완충액( 표 1 참조)으로 보충한다.
8. 비오틴 풀다운
- 샘플당 150μL의 C1 스트렙타비딘 비드( 재료 표 참조)를 1.5mL 튜브에 옮기고 1.5mL 튜브 자석에 놓고 2-3분 동안 또는 모든 비드가 벽에 달라붙을 때까지 기다립니다. 상청액을 제거하고 비드를 남겨 둡니다.
- 400 μL의 1x 트윈 완충액(TB, 표 1 참조)으로 비드를 세척합니다. 비드를 씻으려면 버퍼를 추가하고 부드러운 와동으로 다시 매달아 놓습니다. 튜브를 자석에 다시 넣고 2-3분 동안 또는 모든 비드가 벽에 달라붙을 때까지 기다립니다. 상청액을 제거하고 비드를 남겨 둡니다.
- 비드를 300 μL의 1x no Tween 완충액(NTB; 표 1 참조)으로 세척합니다. 300μL의 2x NTB에 비드를 재현탁합니다( 표 1 참조).
알림: 비드는 세제 없이 버퍼로 세척할 때 튜브 벽 주위에 먼지가 많은 층을 형성할 수 있습니다. 이는 정상이며 프로토콜의 결과에 영향을 주지 않습니다. - 2x NTB에 담긴 이 300 μL의 비드를 300 μL의 시료와 결합합니다. 실온에서 회전하여 비오틴으로 유익한 DNA 단편을 풀다운하기 위해 15분 동안 배양합니다. 라이브러리는 이제 C1 스트렙타비딘 비드에 붙어 있습니다.
- 400μL의 1x NTB로 비드를 세척합니다. 비드를 100 μL의 TLE 완충액으로 세척한 후 35.7 μL의 TLE 완충액에 재현탁합니다.
9. dATP-테일링, 어댑터 결찰 및 PCR 증폭
- 마스터믹스를 준비하고 다음 시약을 샘플에 추가하여 복구된 DNA 단편의 말단을 dATP-tail에 추가합니다: 5μL의 10x 제한 완충액 2, 2.3μL의 10mM dATP 및 7μL의 5U/μL Klenow 엑소-. 샘플을 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- Klenow 엑소-샘플을 65°C에서 10분 동안 더 인큐베이션하여 불활성화시킨다. 얼음 위에서 샘플을 식히십시오. 300μL의 1x TB로 비드를 세척합니다. 300μL의 1x NTB로 비드를 세척합니다.
- 100μL의 1x 결찰 완충액으로 비드를 세척한 후 50μL의 1x 결찰 완충액에 재현탁합니다. 4μL의 15μM 사전 어닐링된 어댑터 믹스(표 2 참조)와 1μL의 2,000U/μL T4 DNA 리가아제(재료 표 참조)를 샘플에 추가합니다.
- 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 400μL의 1x TB로 비드를 세척합니다. 200μL의 1x NTB로 비드를 세척합니다. 비드를 100 μl의 1x 제한 완충액 2로 세척한다.
- 50μL의 1x 제한 버퍼 2로 비드를 세척한 후 50μL의 1x 제한 버퍼 2에 재현탁합니다.
- 라이브러리를 증폭하기 위해 PCR 반응을 준비하기 위해 다음의 시약을 혼합한다: 라이브러리가 있는 비드 50 μL, 효소가 포함된 2x PCR 마스터믹스 250 μL, F+R 프라이머 12 μL(각각 25 μM; 표 2 참조) 및 뉴클레아제가 없는 물 188 μL.
- 다음 조건으로 PCR을 수행합니다(PCR 시약 혼합물을 50μL 반응으로 분할): 98°C에서 40초, 98°C에서 10초, 65°C에서 30초, 72°C에서 30초, 72°C에서 10분 동안 마무리합니다. 4 °C에서 유지하십시오.
참고: 라이브러리 캡처 전에 500-1,000ng 출력을 목표로 하는 이배체 셀에서 프로토콜을 최적화하기 위한 시작점으로 다음 사이클 수를 사용하십시오: 8주기 동안 100만 개의 세포; 10 사이클 동안 250,000 셀; 12 사이클 동안 50,000 셀. - 동일한 샘플의 모든 50μL 반응을 1.5mL DNA 저결합 튜브에 풀링하고 1.5mL 튜브 자석에 놓고 2-3분 동안 기다리거나 모든 비드가 벽에 달라붙을 때까지 기다립니다.
- 라이브러리(500 μL)가 들어 있는 상청액을 새로운 1.5 mL DNA 저결합 튜브로 옮깁니다. 상층액의 일부가 손실된 경우 TLE 버퍼를 500μL로 보충합니다. C1 스트렙타비딘 비드는 더 이상 필요하지 않습니다.
- 상자성 비드 정제(0.4-1 부피)를 사용하여 양면 선택(55 )을 수행한다. 이를 통해 폴리에틸렌 글리콜 및 첨가된 상자성 비드의 염의 농도에 따라 너무 큰(>1,000bp) 및 너무 작은 단편 또는 PCR 프라이머(<200bp)를 선택적으로 제거할 수 있습니다.
- 200 μL(0.4 부피)의 스톡 비드를 라이브러리에 추가하고 볼텍싱으로 혼합합니다. 실온에서 회전하면서 10분 동안 배양합니다.
- 자석에 놓고 2-3분 정도 기다리거나 모든 비드가 벽에 달라붙을 때까지 기다렸다가 라이브러리가 들어 있는 상층액(더 큰 조각 제외)을 새로운 1.5mL DNA 저결합 튜브로 옮깁니다.
- 750 μL의 스톡 비드를 취하여 비드를 농축하고, 자석의 1.5 mL 튜브에 넣고, 2-3 분 동안 기다리거나 모든 비드가 벽에 달라 붙을 때까지 기다렸다가 상청액을 제거하고, 300 μL의 새로운 스톡 비드에서 볼텍싱하여 비드를 다시 현탁시킵니다.
- 이 300μL의 농축 비드를 샘플(1부피)에 추가하고 볼텍싱으로 혼합합니다. 실온에서 회전하면서 10분 동안 배양합니다. 자석에 놓고 2-3분 정도 기다리거나 모든 비드가 벽에 달라붙을 때까지 기다렸다가 상층액(더 작은 단편과 PCR 프라이머 포함)을 제거합니다.
- 비드를 70% 에탄올 1mL로 3회 세척한다. 이렇게하려면 구슬이 달린 튜브가 자석 위에있는 동안 에탄올을 넣고 구슬을 방해하지 않고 30-60 초 동안 기다리십시오. 그런 다음 비드를 방해하지 않고 상청액을 제거합니다.
- 비드를 자연 건조시키고 볼텍싱을 통해 21μL의 TLE 버퍼에 다시 현탁합니다.
참고: 비드를 과도하게 건조하면 DNA를 용출할 때 수율이 감소할 수 있습니다. 에탄올에서 더 이상 "광택"이 나지 않는 직후 TLE 완충액에 재현탁하는 것을 목표로 합니다. - 샘플을 37°C에서 10분 동안 Thermoblock에서 인큐베이션하여 비드로부터 라이브러리를 용출시켰다. 튜브를 자석에 넣고 라이브러리가 들어 있는 상층액을 새로운 1.5mL DNA 저결합 튜브로 옮깁니다.
- 자동 전기영동으로 크기와 농도를 정량화합니다( 재료 표 참조). 정제된 Hi-C 재료는 프로토콜을 진행하기 전에 몇 달 동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
10. 라이브러리 캡처
- 500-1,000ng의 라이브러리로 작업하십시오. 진공 농축기를 사용하여 DNA를 건조시키고 뉴클레아제가 없는 물 3.4μL에 물질을 재현탁하여 라이브러리를 농축합니다.
- 표적 농축 키트( 재료 표 참조)에서 2.5μL의 Blocker 1, 2.5μL의 Blocker 2 및 0.6μL의 어댑터용 맞춤형 Ol고 차단제를 샘플에 추가합니다.
- 완전히 재현탁하고 용액을 0.2mL PCR 스트립으로 옮기고 95°C에서 5분 동안 열순환기에서 배양한 다음 가열된 뚜껑을 사용하여 65°C에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 65°C에서 배양한 상태로 둡니다.
- 시료(13 μL)당 표적 농축 키트(표 재료 표 참조)로부터 다음의 시약을 조합하여 하이브리드화 용액을 준비한다. 실온에서 벤치에 보관하십시오: Hyb 1 6.63μL, Hyb 2 0.27μL, Hyb 3 2.65μL, Hyb 4 3.45μL.
- 시료당 1.5μL의 뉴클레아제가 없는 물로 표적 농축 키트의 RNase 블록 0.5μL를 희석합니다. 샘플당 5 μL의 비오티닐화된 RNA를 얼음 위에서 해동하고 희석된 RNase 블록 2 μL를 첨가합니다. 실온에서 벤치에 보관하십시오.
- 하이브리드화 용액 13 μL를 RNase와 함께 비오티닐화된 RNA 7 μL에 첨가하고 잘 섞는다.
- 65°C에서 열순환기 상에서 하이브리드화 용액을 비오티닐화 RNA(20 μL)와 함께 블록화된 라이브러리로 옮깁니다. 튜브 뚜껑을 단단히 닫고 65°C에서 밤새 열순환기에서 배양합니다.
참고: 여러 샘플을 동시에 수행할 때 샘플 증발(최적이 아닌 RNA-DNA 혼성화로 이어질 수 있음)을 최소화하려면 멀티채널 피펫을 사용하여 비오티닐화된 RNA를 각 라이브러리로 동시에 전송합니다.
11. 비오틴 풀다운 및 PCR 증폭
- 샘플당 50μL의 T1 스트렙타비딘 비드를 1.5mL DNA 저결합 튜브에 옮기고 1.5mL 튜브 자석에 놓고 2-3분 동안 기다리거나 모든 비드가 벽에 달라붙을 때까지 기다립니다. 상청액을 제거하고 비드를 남겨 둡니다. 표적 농축 키트에서 200 μL의 결합 완충액으로 비드를 세 번 세척합니다.
- 200 μL의 결합 완충액에 비드를 재현탁합니다. 65°C에서 열순환기 상에서 샘플을 재현탁된 T1 스트렙타비딘 비드로 옮기고 실온에서 회전하면서 30분 동안 인큐베이션합니다.
- 표적 농축 키트에서 200 μL의 세척 완충액 1로 비드를 세척합니다. 실온에서 회전하면서 15분 동안 배양합니다. 65°C로 가열된 표적 농축 키트로부터의 200 μL의 세척 완충액 2로 비드를 3회 세척한다. thermoblock에서 65°C에서 10분 동안 인큐베이션하고, 세척 사이에 300 rpm으로 진탕한다.
- 비드를 200μL의 1x 제한 버퍼 2로 세척한 후 30μL의 1x 제한 버퍼 2에 재현탁합니다.
- 라이브러리를 증폭하기 위해 다음 시약을 혼합하여 PCR 반응을 제조한다: 라이브러리가 있는 30 μL 비드, 효소가 있는 2x PCR 마스터믹스 150 μL, F+ R 프라이머 7.2 μL (각각 25 μM; 표 2 참조), 및 뉴클레아제가 없는 물 112.8 μL.
- 다음 조건으로 PCR을 수행합니다(PCR 시약 혼합물을 50 μL 반응으로 분할): 98°C에서 40초, 98°C에서 10초, 65°C에서 30초, 72°C에서 30초, 72°C에서 10분 동안 4회 사이클을 수행합니다. 4 °C에서 유지하십시오.
- 동일한 샘플의 모든 50μL 반응을 1.5mL DNA 저결합 튜브에 풀링하고 1.5mL 튜브 자석에 놓고 2-3분 동안 기다리거나 모든 비드가 벽에 달라붙을 때까지 기다립니다.
- 라이브러리(300 μL)가 들어 있는 상청액을 새로운 1.5 mL DNA 저결합 튜브로 옮깁니다. 상층액의 일부가 손실된 경우 TLE 버퍼를 300μL로 보충합니다. T1 스트렙타비딘 비드는 더 이상 필요하지 않습니다.
- 상자성 비드(0.9 volumes; Table of Materials)를 사용하여 DNA 정제를 수행합니다. 270 μL의 스톡 비드를 샘플에 추가하고 볼텍싱으로 혼합합니다.
- 실온에서 회전하면서 10분 동안 배양합니다.
- 자석에 놓고 2-3분 정도 기다리거나 모든 구슬이 벽에 달라붙을 때까지 기다렸다가 상층액을 제거합니다.
- 비드를 70% 에탄올 1mL로 3회 세척한다. 이렇게하려면 구슬이있는 튜브가 여전히 자석 위에있는 동안 에탄올을 넣고 구슬을 방해하지 않고 30-60 초 동안 기다리십시오. 그런 다음 비드를 방해하지 않고 상청액을 제거합니다.
- 비드를 자연 건조시키고 볼텍싱을 통해 21μL의 TLE 버퍼에 다시 현탁합니다.
참고: 비드를 과도하게 건조하면 DNA를 용출할 때 수율이 감소할 수 있습니다. 에탄올에서 더 이상 "광택"이 나지 않는 직후 TLE 완충액에 재현탁하는 것을 목표로 합니다. - 샘플을 37°C에서 10분 동안 Thermoblock에서 인큐베이션하여 비드로부터 라이브러리를 용출시켰다.
- 튜브를 자석에 넣고 라이브러리가 들어 있는 상층액을 새로운 1.5mL DNA 저결합 튜브로 옮깁니다.
- 자동 전기영동으로 크기와 농도를 정량화합니다.
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Representative Results
liCHi-C는 50,000 개의 세포로 고품질의 게놈 전체 프로모터 상호 작용체 라이브러리를 생성 할 수있는 가능성을 제공합니다53. 이는 반응 부피의 급격한 감소와 프로토콜 전반에 걸쳐 DNA 저결합 플라스틱 용기의 사용 외에도 상당한 재료 손실이 발생하는 원래 프로토콜에서 불필요한 단계를 제거함으로써 달성됩니다. 여기에는 탈가교 후 페놀 정제, 비오틴 제거, 후속 페놀-클로로포름 정제 및 에탄올 침전이 포함됩니다. 그 외에도 Hi-C 라이브러리 준비 단계(비오틴 풀다운, A-테일링, 어댑터 결찰, PCR 증폭 및 양면 상자성 비드 선택 - PCR 산물 정제이기도 함)를 재구성하면 또 다른 불필요한 DNA 정제 단계를 제거할 수 있습니다. 실험 워크플로의 개요는 그림 1A에서 찾을 수 있습니다.
라이브러리 품질을 평가하기 위해 프로토콜 전반에 걸쳐 여러 제어가 수행되며, 그 중 첫 번째는 게놈 소화 효율 계산입니다. 80%를 초과하는 값은 허용 가능한 것으로 간주됩니다(표 3). 단일 liCHi-C 실험에서 상당한 양의 물질을 잃지 않기 위해 별도의 실험에서 세포 유형의 소화 효율을 확인하는 것이 제안됩니다. 둘째, 초음파 처리 및 최종 복구 전에 기존 PCR에 의한 세포 유형 불변 염색질 상호 작용을 증폭하여 상호 작용 감지의 민감도를 확인하는 것이 좋습니다 (그림 1B). 특정 산물이 검출되면 이전에 얻은 PCR 산물 중 하나를 HindIII 및 NheI로 차등적으로 분해하여 비오티닐화 및 결찰의 효율성에 초점을 맞춘 세 번째 제어를 수행해야 합니다(그림 1C,D). 소화된 HindIII 제한 부위를 채우고 다른 부위로 무딘 결찰을 할 때 원래 HindIII 제한 부위를 재생하는 대신 새로운 NheI 제한 부위가 생성됩니다. 따라서 PCR 앰플리콘의 소화는 NheI가 존재할 때만 관찰되어야 합니다. 마지막으로, 전체 포획 직전과 직후에 자동 전기영동을 사용하여 농도 및 크기 분포를 확인해야 합니다. 사전 캡처 라이브러리 증폭은 RNA 프로브 캡처를 수행하는 데 필요한 정확한 양인 500-1,000ng의 Hi-C 물질을 얻는 것을 목표로 해야 하는데, 이는 사전 및 사후 캡처 라이브러리의 과도한 증폭으로 인해 PCR 중복의 비율이 높아지고 결과적으로 분석 중 염기서열 분석 판독이 손실되기 때문입니다. 라이브러리는 첫 번째 보존적 PCR 증폭 동안 충분한 물질이 얻어지지 않는 경우 동일한 조건에서 다시 재증폭될 수 있습니다. 캡처 후 라이브러리 자료의 양은 다양할 수 있지만 일반적으로 캡처 전보다 약 10배에서 20배 적어야 합니다. 라이브러리의 크기 분포는 약 450-550bp(그림 2A,B)에 속해야 하며, 사전 캡처된 라이브러리와 사후 캡처 라이브러리 간에 변하지 않습니다. 종합적으로, 이러한 제어의 올바른 결과는 우수한 liCHi-C 라이브러리의 생성을 보장합니다.
완성 된 liCHi-C 라이브러리는 (적어도) 100 bp paired-end 시퀀싱되고 분석됩니다. 원시 시퀀싱 데이터(53 )는 아티팩트를 매핑하고 필터링하기 위해 HiCUP 파이프라인(56 )을 사용하여 처리된다. 이상적인 HiCUP 보고서는 이전에 핵 내 결찰 Hi-C 57에 따라 설명한 바와 같이 트랜스(다른 염색체 간) 쌍단 판독에 비해 시스 분포(동일한 염색체 내부)가 5배에서10 배 증가했음을 보여줍니다(그림 3B). PCR 중복을 제거한 후 1억 개 이상의 고유하고 유효한 판독을 획득하면 포획 효율을 평가하는 분석의 다음 단계(그림 3B)로 진행하기에 충분합니다. RNA 프로브 농축 시스템에 의해 포획된 제한 단편에 말단이 매핑되지 않는 쌍말단 판독은 폐기되고 세포의 프로모터 상호작용을 나타내는 것만 유지합니다(즉, 말단 중 하나 이상이 하나 이상의 유전자 프로모터를 포함하는 제한 단편에 매핑되는 판독[그림 3C], 이상적으로는 60 % 이상.
마지막으로,58,59에 설명 된대로 CHiCAGO 파이프 라인과 중요한 상호 작용이 호출됩니다. 2개 이상의 생물학적 복제물은 중요한 프로모터 상호작용의 최종 세트에 필요합니다. 주성분 분석(PCA)을 사용하여 데이터 품질을 검증할 수도 있는데, 이는 생물학적 복제물이 함께 클러스터링되어야 하고 세포 유형이 분리되어야 하기 때문입니다. 예를 들어, 인간 조혈 트리(일반 골수 전구세포, 단핵구, 거핵구 및 적혈구)의 4가지 다른 1차 세포 유형에서 liCHi-C 데이터 세트를 분석함으로써 PCA에서 liCHi-C 라이브러리가 발달 궤적 반영 방식으로 클러스터링되는 것을 관찰할 수 있습니다(그림 3D). 4가지 세포 유형에 대해 검출된 중요한 상호작용을 면밀히 조사하면 프로모터 상호작용체가 세포 발달 중에 세포 유형에 특이적이고 역동적이라는 것을 알 수 있습니다. 예를 들어, 헤모글로빈60,61,62의 올바른 접힘을 감독하는 적혈구 전구체에서 합성된 핵심 샤페론인 AHSP 유전자는 적혈구에서 잠재적으로 활성 조절 요소(즉, H3K27ac 및 H3K4me1 농축 영역)와의 상호 작용 이득을 보여주지만 다른 세포 유형에서는 그렇지 않습니다(그림 4). 이것은 liCHi-C 방법이 희귀 세포 유형에서 잠재적인 조절 상호작용을 밝힐 수 있음을 보여줍니다.
그림 1 : 초음파 처리 전 샘플의 프로토콜 개요 및 품질 관리. (A) 일로 나눈 liCHi-C 프로토콜의 개략도. B와 파란 손은 각각 비오틴 분자와 오랜 시간 동안 프로토콜을 안전하게 중지할 수 있는 단계를 나타냅니다. (B) 3C 상호 작용 제어의 대표적인 결과. 사람(왼쪽)과 마우스(오른쪽)에 대한 상호 작용 집합이 모두 표시됩니다. 예상되는 밴드는 진한 파란색으로 표시되고 불특정 밴드는 연한 파란색으로 표시됩니다. (C) "Dekker" 인간 상호작용 프라이머 쌍을 사용한 대표적인 필인 및 결찰 제어. 밴드는 NheI가 추가되는 레인 2와 3에서만 절단됩니다. (D) HindIII 제한 부위의 채우기 및 결찰 중 새로운 NheI 제한 부위 생성의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 포획 전후 라이브러리의 대표적인 자동 전기영동 프로파일. (A) 포획 직전 라이브러리의 자동 전기영동 프로파일. 얻은 DNA의 총량은 994ng(20μL에서 49.7ng/μL)입니다. (B) 완성된 liCHi-C 라이브러리의 고감도 자동 전기영동 프로파일. 샘플은 가능한 한 많은 물질을 보존하기 위해 반쯤 희석되어 로드됩니다. 얻은 DNA의 총량은 61.2ng(희석을 설명하기 위해 20μL x2에서 1.53ng/μL)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PCA에 의한 대표적인 HiCUP 파이프라인 출력 및 샘플 복제 클러스터링. (A) 백분율 및 총 개수에 따른 읽기 쌍의 유효성 분류. 유효하지 않은 읽기 쌍은 실험적 아티팩트 유형에 따라 하위 분류됩니다. (B) 중복 제거 비율 및 상호 작용 유형의 분류. Cis 상호 작용은 cis-close(10kb 미만) 및 cis-far(10kb 이상)로 더 세분화됩니다. (C) 캡처 효율의 백분율. 캡처된 판독-쌍은 한쪽 끝, 다른 쪽 또는 둘 모두가 하나 이상의 프로모터를 포함하는지 여부에 관계없이 추가로 하위 분류됩니다. (D) 일반적인 골수 전구체(CMP), 적혈구, 거핵구 및 단핵구의 liCHi-C 라이브러리의 두 복제물에서 CHiCAGO 유의한 상호작용 점수의 주성분 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 인간 일차 조혈 세포에서의 AHSP 상호작용 환경. WashU Epigenome Browser63에서 볼 수 있는 일반적인 골수성 전구세포(CMP), 적혈구세포(Ery), 거핵구(MK) 및 단핵구(Mon)에서 AHSP 프로모터 중심 상호작용 환경의 대표적인 예입니다. 호는 중요한 상호 작용을 나타냅니다. 짙은 파란색 음영은 AHSP 유전자 프로모터를 나타내고, 밝은 파란색 음영은 적혈구에서 AHSP 프로모터와 특이적으로 상호 작용하는 잠재적인 활성 조절 요소와 겹칩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 완충액 조성 및 준비. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: PCR 프라이머 및 어댑터 서열. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 소화 효율 계산의 예. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
liCHi-C는 PCHi-C와 유사한 실험 프레임워크를 사용하지만 세포 수가 크게 감소한 고분해능 프로모터 상호작용체 라이브러리를 생성할 수 있는 기능을 제공합니다. 이것은 페놀 정제 및 비오틴 제거와 같은 불필요한 단계를 제거함으로써 크게 달성됩니다. 고전적인 핵 내 결찰 Hi-C 프로토콜57 및 후속 파생 기술인 PCHi-C에서, 비오틴은 나중에 정보가 없는 DNA 단편을 끌어내리는 것을 피하기 위해 비결찰 제한 단편에서 제거됩니다. 이 부분과 후속 DNA 정제를 건너뛰어도 DNA 정제와 같은 잠재적인 DNA 소모 단계를 차단하면서 유효한 판독 비율이 크게 감소하지 않습니다(그림 3A). 초음파 처리 후 Hi-C 라이브러리 준비의 재구성은 정제 단계 자체로 양면 선택을 사용하여 또 다른 불필요한 정제를 건너 뛸 수 있습니다. 이 모든 것이 최소한의 튜브 변경을 사용하여 전체 프로토콜의 성능을 향상시키고, 반응 부피의 감소, 시약 농도의 변화 및 DNA 저결합 플라스틱 용기의 사용과 함께 50,000개의 세포만 사용하여 고품질 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 시작 셀 번호는 라이브러리의 복잡성으로 인해 중요한 상호 작용의 수를 부분적으로 결정한다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 50,000개의 세포로 생성된 라이브러리는 더 복잡한 라이브러리(53)의 세포 유형 특이적 및 불변 토폴로지 특징을 유지하지만, 더 많은 수의 중요한 프로모터 상호작용을 포착하기 위해 가능하면 생물학적 복제당 100,000개 이상의 세포를 사용하는 것이 좋습니다.
3C 기술에서 검출 된 상호 작용의 분해능은 본질적으로 사용 된 제한 효소에 의해 주어집니다. 여기서, liCHi-C의 적용은 4,096 bp의 이론적 평균 분해능을 제공하는 6 bp- 절단 효소 인 HindIII를 사용하여 설명된다. 4bp-절단 MboI 효소에 대한 HindIII 제한 효소를 전환하는 liCHi-C 라이브러리의 생성은 검출된 상호 작용의 평균 선형 거리가 거리의 절반으로 감소했음에도 불구하고 총 상호 작용의 거의 두 배를 감지하는 우수한 결과를 제공하는 것으로 보고되었습니다53.
실제 RNA 프로브 농축 시스템과 관련하여, HiChIP32 또는 HiCuT33과 같은 항체 기반 포획에 비해 이러한 유형의 포획을 사용하는 주요 이점 중 하나는 단백질의 결합과 독립적으로 조건을 비교할 수 있을 뿐만 아니라 관심 있는 단백질에 대한 작동 항체의 가용성에 의존할 필요가 없다는 것입니다. 또한, RNA 농축 시스템은 각 연구자의 필요에 맞게 게놈 전체의 특정 영역을 캡처하도록 맞춤화할 수 있습니다(설계는35,64에서 논의됨).
항체 기반 포획 방법 외에도 3D 게놈 아키텍처를 조사하기 위한 몇 가지 뛰어난 단일 세포(예: scHi-C 65, Dip-C 66 또는 Sci-Hi-C67) 또는 저입력 방법(예: Low-C68 또는 Easy Hi-C 69)이 최근 몇 년 동안 개발되었습니다. 그러나 이들은 원위 조절 요소와 표적 유전자 사이의 접촉을 식별할 수 없는 저해상도의 희소 접촉 지도를 생성합니다. liCHi-C는 이러한 한계를 극복할 수 있는 방법으로, 희소한 세포 유형에서 프로모터 중심 게놈 구조를 연구할 수 있는 가능성을 열어주고 세포 및 발달 생물학과 질병 발달에 대한 이해를 높일 수 있는 기회를 제공합니다.
모든 기능에도 불구하고 liCHi-C는 제한에서 면제되지 않습니다. 첫째, 원시 시퀀싱 데이터를 처리하는 것은 간단하지 않으며 데이터를 분석하고 결과를 해석하려면 공정한 계산 기술이 필요합니다. 또한 liCHi-C는 기능적 상호 작용과 구조적 상호 작용을 구별하지 않습니다. 유전자 프로모터와 표적 조절 요소의 잠재적인 기능적 상호작용을 검증하기 위해 liCHi-C 데이터를 후성유전학적 데이터 및/또는 기능 분석과 통합해야 합니다. 마지막으로, 라이브러리 복잡성은 셀 번호의 하단에서 작업할 때 희생됩니다. 이는 더 높은 세포 수의 liCHi-C 라이브러리와 비교하여 감지된 고유한 상호 작용의 양과 최대 80%에 달할 수 있는 중복 제거율에 반영됩니다. 그러나, 낮은 세포 수의 liCHi-C 라이브러리는 더 높은 세포 수 라이브러리의 토폴로지 특징을 보다 집중적인 방식으로 유지하며(53), 50,000개 정도의 세포로 세포의 프로모터 상호작용을 요약하는 liCHi-C 라이브러리를 수행하는 것이 가능하다는 것을 보여줍니다.
전반적으로 liCHi-C는 희소한 세포 유형에서 고품질 및 고분해능 프로모터 상호작용체 라이브러리를 생성하는 비용 효율적이고 사용자 정의 가능한 방법입니다. 프로모터 상호작용을 매핑하고 제한 단편 분해능에서 중요한 루프를 호출하는 최초의 낮은 입력 방법입니다. 우리는 이 새로운 도구가 이전 PCHi-C와 마찬가지로 건강과 질병 모두에서 세포 분화와 유기체 발달에 대한 새로운 통찰력을 제공할 것으로 예상합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
원고에 대한 피드백을 주신 Javierre 연구실의 나머지 구성원들에게 감사드립니다. 제도적 지원을 해주신 CERCA 프로그램, Generalitat de Catalunya 및 Josep Carreras Foundation에 감사드립니다. 이 연구는 FEDER/스페인 과학혁신부(RTI2018-094788-A-I00), 유럽 혈액학 협회(4823998) 및 스페인 암 퇴치 협회(AECC) LABAE21981JAVI의 자금 지원을 받았습니다. BMJ는 La Caixa Banking Foundation Junior Leader 프로젝트(LCF/BQ/PI19/11690001)에서 자금을 지원하고, LR은 AGAUR FI 펠로우십(2019FI-B00017)에서 자금을 지원하며, LT-D는 FPI Fellowship(PRE2019-088005)에서 자금을 지원합니다. Universitat Autònoma de Barcelona의 생화학 및 분자 생물학 박사 과정의 지원에 감사드립니다. 자금 제공자 중 누구도 실험 설계나 원고 작성의 어느 시점에도 관여하지 않았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mM Biotin-14-dATP | Invitrogen | 19524-016 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 1 M Tris pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | |
| 10x NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 10x T4 DNA ligase reaction buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| 20 mg/mL Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9000S | |
| 5 M NaCl | Invitrogen | AM9760G | |
| 5PRIME Phase Lock Gel Light tubes | Qiuantabio | 2302820 | For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube |
| Adapters and PCR primers for library amplification | Integrated DNA Technologies | - | Bought as individual primers with PAGE purification for NGS |
| Cell scrappers | Nunc | 179693 | Or any other brand |
| Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) | Any brand | ||
| CHiCAGO R package | 1.14.0 | ||
| CleanNGS beads | CleanNA | CNGS-0050 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U120A, U121A, U122A, U123A | Or any other brand |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
| DNA LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
| DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL | New England Biolabs | M0210L | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65002 | For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down) |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65602 | For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 12321D | Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.321 | |
| FBS, qualified | Gibco | 10270-106 | Or any other brand |
| Glycine | Fisher BioReagents | BP381-1 | |
| GlycoBlue Coprecipitant | Invitrogen | AM9515 | Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification) |
| HiCUP | 0.8.2 | ||
| HindIII, 100 U/µL | New England Biolabs | R0104T | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ML | |
| Klenow EXO- 5000 units/mL | New England Biolabs | M0212L | |
| Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) | ZeroTip | PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials | Covaris | 520045 | For sonication in section 6 (sonication) |
| NheI-HF, 100 U/µL | New England Biolabs | R3131M | |
| Nuclease-free molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| PCR primers for quality controls | Integrated DNA Technologies | - | |
| PCR strips and caps | Agilent Technologies | 410022, 401425 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531L | For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche | 3115836001 | |
| Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit | Invitrogen | Q33230 | For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification) |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| rCutsmart buffer | New England Biolabs | B6004S | |
| RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | Or any other brand |
| SDS - Solution 10% for molecular biology | PanReac AppliChem | A0676 | |
| Sodium acetate pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899-100ML | |
| SureSelect custom 3-5.9 Mb library | Agilent Technologies | 5190-4831 | Custom designed mouse or human capture system, used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent Technologies | 5190-8645 | Used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter | Agilent Technologies | 931107 | Used for the capture |
| T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 15224025 | For ligation in section 3 (ligation and decrosslink) |
| T4 DNA ligase 2000000/mL | New England Biolabs | M0202T | For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) |
| T4 DNA polymerase 3000 units/mL | New England Biolabs | M0203L | |
| T4 PNK 10000 units/mL | New England Biolabs | M0201L | |
| Tapestation 4200 instrument | Agilent Technologies | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
|
| Tapestation reagents | Agilent Technologies | 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
| Triton X-100 for molecular biology | PanReac AppliChem | A4975 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML |
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