Agrobacterium tumefaciens-緑色微細藻類Chlorella vulgarisの遺伝子工学
Summary
このプロトコルは安定した形質転換剤の生産をもたらす緑の微細藻類Chlorella vulgarisの核ゲノムに興味の遺伝子を統合するためのアグロバクテリウムのtumefaciens仲介された変形(AMT)の利用を輪郭を描く。
Abstract
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した形質転換(AMT)は、植物ゲノムを操作するための広く採用されているツールとして機能します。しかし、 A. tumefaciensは 、多様な種への遺伝子導入能力を示します。多くの微細藻類種は、目的の遺伝子を核ゲノムに確実に組み込むための確立された方法を欠いています。微細藻類バイオテクノロジーの潜在的な利点を利用するには、シンプルで効率的なゲノム操作ツールが不可欠です。本明細書では、ハイグロマイシンBおよびセフォタキシムを含むトリスアセテートリン酸(TAP)培地へのめっきによって、レポーター緑色蛍光タンパク質(mGFP5)およびハイグロマイシンBの抗生物質耐性マーカーを利用して、工業用微細藻類種 クロレラ・ブルガリスに最適化されたAMTプロトコルが提示されます。mGFP5の発現は、継代培養の10世代以上後に蛍光 によって 定量され、T-DNAカセットの安定した形質転換を示しています。このプロトコルは市販のpCAMBIA1302植物の表現のベクトルを用いる2週以下で多数のtransgenic C. vulgaris のコロニーの信頼できる生成を可能にする。
Introduction
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、グラム陰性土壌伝染性細菌であり、独自の王国間遺伝子導入能力を有しており、「天然遺伝子工学者」1の称号を得ています。この細菌は、腫瘍誘導プラスミド(Ti-プラスミド)からIV型分泌系を介して宿主細胞にDNA(T-DNA)を移し、宿主ゲノム1,2,3,4内にT-DNAを統合して発現させることができます。自然界では、このプロセスは植物の腫瘍形成につながり、一般にクラウンゴール病として知られています。しかし、アグロバクテリウムは、実験室条件下で酵母、真菌、藻類、ウニ胚、さらにはヒト細胞など、他のさまざまな生物にT-DNAを転写することもできます5,6,7,8。
この自然システムを利用して、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した形質転換(AMT)は、TiプラスミドのT-DNA領域を修飾することにより、目的の遺伝子を宿主細胞の核ゲノムにランダムに組み込むことができます。この目的のために、広く用いられているAMT植物発現ベクターは、pCAMBIA13029である。研究者は、目的のベクターをA. tumefaciensに移植し、その後目的の宿主に移植する前に、大腸菌で簡単なクローニングワークフローを採用することができます。
緑色微細藻類は、陸上植物と多くの類似点を共有する真核生物ですが、遺伝子組み換えに対して非常に抵抗性があります。しかし、遺伝子組み換えは、微細藻類の基礎研究とバイオテクノロジー研究の両方において重要な役割を果たしています。いくつかの微細藻類種、特にクラミドモナス・ラインハルトティでは、AMTによる遺伝子組み換えにより、ヒトインターロイキン-2(hIL-2)、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2受容体結合ドメイン(SARS-CoV-2 RBD)、および2つの抗菌ペプチド(AMP)などの導入遺伝子の導入に成功しています10,11,12,13。これらのうち、尋常性クロレラ(Chlorella vulgaris)は、あまり気難しくなく、成長の早い緑藻類種であり、炭水化物、タンパク質、栄養補助食品、色素、およびその他の高価値化合物の持続可能な生産に大きな可能性を秘めています14。しかし、C. vulgarisのトランスジェニック株を作製するための信頼できるツールの欠如が、その商業的進歩を妨げている。C. vulgaris15 で AMT を利用した研究が発表されているのは限られているため、植物と微細藻類の培養には大きな違いがあるため、AMT プロトコルの最適化が不可欠になります。
この研究では、研究者らは、カリフラワーモザイクウイルス(CamV)35Sプロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質(mGFP5)を挿入し、ヒスチジンタグを付加して、タンパク質発現のレポーター遺伝子として使用しました。形質転換体はハイグロマイシンBを用いて選別され、20世代以上にわたって継代培養された後、形質転換は安定していました。この研究で用いたpCAMBIA1302プラスミドは、任意の目的遺伝子を含むように容易に適合させることができます。さらに、提示された方法および材料は、活性CamV35Sプロモーターを有する他の緑藻種について調整することができ、このプロモーターはハイグロマイシンの選択に使用される。
Protocol
Representative Results
Discussion
変換の効率は、いくつかの異なるパラメータに関連しています。AMTに使用される A.tumefaciens 株の選択は重要です。AGL-1は、発見された最も侵襲性の高い菌株の1つであり、このため、植物AMTで日常的に使用されています。 誘導媒体にグルコース(15〜20 mM)を補給することも、AMTの効率にとって重要です。 C. vulgaris は光栄養条件と従属栄養条件の両方で増殖できることを考慮すると?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、オランダのライデン大学ライデン生物学研究所からpCAMBIA1302ベクターと アグロバクテリウム・ツメファシエンス AGL1を提供してくださったPaul Hooykaas教授に感謝します。また、著者らは、蛍光形質転換体の培養に協力してくれたEva Colic氏にも感謝の意を表したい。この研究は、カナダ自然科学・工学研究評議会(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada)とMitacs Accelerateプログラムから資金提供を受けました。
Materials
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
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