פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטרנספורמציה בתיווך גידולים אגרובקטריום (AMT) לשילוב גנים בעלי עניין בגנום הגרעיני של המיקרו-אצות הירוקות Chlorella vulgaris, מה שמוביל לייצור טרנספורמנטים יציבים.
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) משמש ככלי נפוץ למניפולציה של גנומים צמחיים. עם זאת, A. tumefaciens מפגינים יכולת העברת גנים למגוון רחב של מינים. למיני מיקרו-אצות רבים חסרות שיטות מבוססות היטב לשילוב אמין של גנים מעניינים בגנום הגרעיני שלהם. כדי לרתום את היתרונות הפוטנציאליים של ביוטכנולוגיה מיקרו-אצות, כלים פשוטים ויעילים למניפולציה גנומית הם חיוניים. כאן, פרוטוקול AMT ממוטב מוצג עבור מיני מיקרו-אצות תעשייתיות Chlorella vulgaris, תוך שימוש בחלבון הפלואורסצנטי הירוק (mGFP5) ובסמן העמידות לאנטיביוטיקה עבור Hygromycin B. מוטנטים נבחרים באמצעות ציפוי על מדיה Tris-אצטט-פוספט (TAP) המכילה Hygromycin B ו cefotaxime. ביטוי של mGFP5 מכומת באמצעות פלואורסצנטיות לאחר יותר מעשרה דורות של תת-תרבית, מה שמצביע על השינוי היציב של קלטת T-DNA. פרוטוקול זה מאפשר ייצור אמין של מושבות C. vulgaris טרנסגניות מרובות תוך פחות משבועיים, תוך שימוש בווקטור ביטוי הצמחים pCAMBIA1302 הזמין מסחרית.
Agrobacterium tumefaciens, חיידק גראם-שלילי הנישא בקרקע, הוא בעל יכולת העברת גנים בין-מלכותית ייחודית, מה שזיכה אותו בתואר “מהנדס גנטי טבעי”1. חיידק זה יכול להעביר DNA (T-DNA) מפלסמיד הגורם לגידול (Ti-Plasmid) לתאים מארחים באמצעות מערכת הפרשת סוג IV, וכתוצאה מכך אינטגרציה וביטוי של T-DNA בתוך הגנום המארח 1,2,3,4. בסביבה הטבעית, תהליך זה מוביל להיווצרות גידולים בצמחים, הידוע בכינויו מחלת כיס המרה. עם זאת, אגרובקטריום יכול גם להעביר T-DNA לאורגניזמים שונים אחרים, כולל שמרים, פטריות, אצות, עוברים של קיפודי ים, ואפילו תאים אנושיים בתנאי מעבדה 5,6,7,8.
תוך ניצול מערכת טבעית זו, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) מאפשר שילוב אקראי של גנים מעניינים לתוך הגנום הגרעיני של התא המארח על ידי שינוי אזור T-DNA של Ti-plasmid. למטרה זו, וקטור ביטוי צמח AMT בשימוש נרחב הוא pCAMBIA13029. חוקרים יכולים להשתמש בתהליכי שיבוט פשוטים ב- E. coli לפני העברת הווקטור הרצוי ל- A. tumefaciens לצורך העברה לאחר מכן למארח העניין.
מיקרו-אצות ירוקות הן איקריוטים שחולקים קווי דמיון רבים עם צמחי יבשה, אך הם עקשנים מאוד לשינוי גנטי. עם זאת, טרנספורמציה גנטית ממלאת תפקיד מכריע במחקר בסיסי וביוטכנולוגי של מיקרו-אצות. בכמה מיני מיקרו-אצות, במיוחד Chlamydomonas reinhardtii, טרנספורמציה גנטית באמצעות AMT החדירה בהצלחה טרנסגנים כגון אינטרלוקין-2 אנושי (hIL-2), תחום קשירת קולטן קורונה 2 (SARS-CoV-2 RBD), ושני פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs)10,11,12,13. בין אלה, Chlorella vulgaris, מין אצות ירוקות פחות קפדני וגדל במהירות, טומן בחובו פוטנציאל משמעותי לייצור בר-קיימא של פחמימות, חלבונים, חומרים מזינים, פיגמנטים ותרכובות אחרות בעלות ערך גבוה14. עם זאת, היעדר כלים אמינים ליצירת זנים טרנסגניים של C. vulgaris מעכב את התקדמותה המסחרית. מאחר שפורסמו רק מספר מוגבל של עבודות המשתמשות ב-AMT ב-C. vulgaris15, ובהתחשב בהבדלים הניכרים בין גידול צמחים למיקרו-אצות, אופטימיזציה של פרוטוקול AMT הופכת חיונית.
במחקר זה, החוקרים הכניסו חלבון פלואורסצנטי ירוק (mGFP5) במורד הזרם של מקדם וירוס פסיפס הכרובית (CamV) 35S והוסיפו תג היסטידין כדי להשתמש בו כגן כתב לביטוי חלבונים. טרנספורמטורים נבחרו באמצעות היגרומיצין B, ולאחר תרבית משנה במשך למעלה מעשרים דורות, השינוי נשאר יציב. פלסמיד pCAMBIA1302 המשמש בעבודה זו יכול להיות מותאם בקלות להכיל כל גן מעניין. יתר על כן, ניתן להתאים את השיטה והחומרים המוצגים למיני אצות ירוקות אחרות עם מקדם CamV35S פעיל, מכיוון שמקדם זה משמש לבחירת היגרומיצין.
יעילות הטרנספורמציה קשורה למספר פרמטרים שונים. הבחירה בזני A. tumefaciens המשמשים ל- AMT היא קריטית. AGL-1 הוא אחד הזנים הפולשים ביותר שהתגלו, ומסיבה זו נעשה בו שימוש שגרתי ב-AMT צמחי. תוספת של גלוקוז (15-20 מילימול) חשובה גם היא ליעילות AMT. בהתחשב בכך ש-C. vulgaris יכול לגדול הן בתנאים פוטוטרופיים והן …
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות לפרופ’ פול הויקאס על שסיפק באדיבותו את וקטור pCAMBIA1302 ואת Agrobacterium tumefaciens AGL1 מהמכון לביולוגיה בליידן, אוניברסיטת ליידן, הולנד. המחברים רוצים גם להודות לאווה קוליק על עזרתה בגידול טרנספורמטורים פלואורסצנטיים. עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה ותוכנית Mitacs Accelerate.
1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |