تصوير طويل المدى للمجموعات العصبية المحددة باستخدام المنشورات الدقيقة في التي تتحرك بحرية وثابتة الرأس
Summary
عند دمجها مع لوحة رأس وتصميم بصري متوافق مع كل من المجاهر أحادية الفوتون وثنائية الفوتون ، تقدم عدسة المنشور الدقيق ميزة كبيرة في قياس الاستجابات العصبية في عمود عمودي في ظل ظروف متنوعة ، بما في ذلك التجارب التي يتم التحكم فيها جيدا في حالات ثابتة الرأس أو المهام السلوكية الطبيعية في التي تتحرك بحرية.
Abstract
مع تقدم المجهر متعدد الفوتونات والتقنيات الجزيئية ، ينمو التصوير الفلوري بسرعة ليصبح نهجا قويا لدراسة بنية أنسجة المخ الحية ووظيفتها ومرونتها. بالمقارنة مع الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية ، يمكن للفحص المجهري الفلوري التقاط النشاط العصبي بالإضافة إلى مورفولوجيا الخلايا ، مما يتيح تسجيلات طويلة الأجل لمجموعات الخلايا العصبية المحددة بدقة خلية واحدة أو تحت خلوية. ومع ذلك ، يتطلب التصوير عالي الدقة عادة إعدادا مستقرا وثابتا للرأس يقيد حركة ، ويسمح إعداد سطح مستو من الزجاج الشفاف بتصور الخلايا العصبية في مستوى أفقي واحد أو أكثر ولكنه محدود في دراسة العمليات الرأسية التي تعمل عبر أعماق مختلفة. هنا ، نصف إجراء للجمع بين تثبيت لوحة الرأس والمنشور الدقيق الذي يعطي تصويرا متعدد الطبقات ومتعدد الوسائط. لا يتيح هذا المستحضر الجراحي الوصول إلى العمود الكامل للقشرة البصرية للفأر فحسب ، بل يسمح بالتصوير ثنائي الفوتون في وضع ثابت للرأس وتصوير فوتون واحد في نموذج يتحرك بحرية. باستخدام هذا النهج ، يمكن للمرء أخذ عينات من مجموعات الخلايا المحددة عبر طبقات قشرية مختلفة ، وتسجيل استجاباتها تحت حالات ثابتة الرأس وتتحرك بحرية ، وتتبع التغييرات طويلة المدى على مدى أشهر. وبالتالي ، توفر هذه الطريقة فحصا شاملا للدوائر الدقيقة ، مما يتيح المقارنة المباشرة للأنشطة العصبية التي تثيرها المحفزات التي يتم التحكم فيها جيدا وفي إطار نموذج سلوكي طبيعي.
Introduction
ظهر ظهور التصوير الفلوري ثنائي الفوتون في الجسم الحي 1,2 ، الذي يجمع بين التقنيات الجديدة في الأنظمة البصرية ومؤشرات التألق المعدلة وراثيا ، كتقنية قوية في علم الأعصاب للتحقيق في البنية المعقدة والوظيفة واللدونة في الدماغ الحي 3,4. على وجه الخصوص ، توفر طريقة التصوير هذه ميزة لا مثيل لها على الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية من خلال التقاط كل من التشكل والأنشطة الديناميكية للخلايا العصبية ، وبالتالي تسهيل التتبع طويل المدى للخلايا العصبية المحددة5،6،7،8.
على الرغم من نقاط قوته الجديرة بالملاحظة ، فإن تطبيق التصوير الفلوري عالي الدقة غالبا ما يتطلب إعدادا ثابتا ثابتا للرأس يقيد حركة9،10،11. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام سطح زجاجي شفاف لتصور الخلايا العصبية يقيد الملاحظات على مستوى أفقي واحد أو أكثر ، مما يحد من استكشاف ديناميكيات العمليات الرأسية التي تمتد عبر أعماق قشرية مختلفة12.
لمعالجة هذه القيود ، تحدد الدراسة الحالية إجراء جراحيا مبتكرا يدمج تثبيت لوحة الرأس ، والمنشور الدقيق ، والمجهر الصغير لإنشاء طريقة تصوير ذات قدرات متعددة الطبقات ومتعددة الوسائط. يسمح المنشور الدقيق بمراقبة المعالجة الرأسية على طول العمود القشري13،14،15،16 ، وهو أمر بالغ الأهمية في فهم كيفية معالجة المعلومات وتحويلها أثناء تحركها عبر طبقات مختلفة من القشرة وكيف يتم تغيير المعالجة الرأسية أثناء التغيرات البلاستيكية. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بتصوير نفس المجموعات العصبية في نموذج ثابت للرأس وفي بيئة تتحرك بحرية ، بما في ذلك الإعدادات التجريبية متعددة الاستخدامات17،18،19: على سبيل المثال ، غالبا ما يكون تثبيت الرأس مطلوبا للنماذج التي يتم التحكم فيها جيدا مثل تقييم الإدراك الحسي والتسجيلات المستقرة تحت نموذج 2 فوتون ، بينما يوفر التحرك الحر بيئة أكثر طبيعية ومرونة للدراسات السلوكية. لذلك ، فإن القدرة على إجراء مقارنة مباشرة في كلا الوضعين أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا للدوائر الدقيقة التي تتيح استجابات مرنة ووظيفية.
في جوهرها ، يوفر دمج تثبيت لوحة الرأس ، والمنشور الدقيق ، والمجهر في التصوير الفلوري منصة واعدة لاستكشاف تعقيدات بنية الدماغ ووظائفه. يمكن للباحثين أخذ عينات من مجموعات الخلايا المحددة عبر أعماق مختلفة تغطي جميع الطبقات القشرية ، ومقارنة استجاباتهم مباشرة في كل من النماذج الطبيعية التي يتم التحكم فيها جيدا ، ومراقبة تغيراتها طويلة المدى على مدار20 شهرا. يقدم هذا النهج نظرة ثاقبة قيمة حول كيفية تفاعل هذه المجموعات العصبية وتغيرها بمرور الوقت في ظل ظروف تجريبية مختلفة ، مما يوفر نافذة على الطبيعة الديناميكية للدوائر العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، أظهرنا القدرة على مراقبة الخلايا العصبية ومقارنتها مباشرة في ظروف ثابتة الرأس وتتحرك بحرية في نفس المجموعات العصبية. بينما أظهرنا التطبيق في القشرة البصرية ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع العديد من مناطق الدماغ الأخرى ، سواء المناطق القشرية أو النوى العميقة24،<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر السيدة شارو ريدي والبروفيسور ماتيو كارانديني (Cortex Lab) على نصائحهما بشأن البروتوكول الجراحي ومشاركة سلالة الفئران المعدلة وراثيا. نشكر الدكتور نوربرت هوجريف (Inscopix) على توجيهه ومساعدته من خلال تطوير الجراحة. نشكر السيدة أندريا ألديا (صن لاب) على مساعدتها في الإعداد الجراحي ومعالجة البيانات. وقد حظي هذا العمل بدعم من جمعية مورفيلدز الخيرية للعيون.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V. Reshaping the optical dimension in optogenetics. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. The minicolumn hypothesis in neuroscience. Brain. 125, 935-951 (2002).
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).
