تصميم وبناء مجهر مضان أحادي الهدف قابل للتخصيص لتصور شبكات الهيكل الخلوي

Summary

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية بناء مجهر مضان أحادي الهدف وضوء ورقة واستخدامه لتصور شبكات الهيكل الخلوي.

Abstract

ظهرت مركبات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها كنظام نموذجي قيم لدراسة المادة الرخوة غير المتوازنة. إن الالتقاط المؤمن لديناميات هذه الشبكات الكثيفة 3D يستدعي التقسيم البصري ، والذي غالبا ما يرتبط بالمجاهر البؤرية الفلورية. ومع ذلك ، فإن التطورات الأخيرة في الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) قد أثبتت أنها بديل فعال من حيث التكلفة ، وفي بعض الأحيان ، متفوق. لجعل LSFM في متناول باحثي الهيكل الخلوي أقل دراية بالبصريات ، نقدم دليلا للمبتدئين خطوة بخطوة لبناء مجهر مضان متعدد الاستخدامات من مكونات جاهزة. لتمكين تركيب العينة باستخدام عينات الشرائح التقليدية ، يتبع LSFM تصميم ورقة الضوء أحادية الهدف (SOLS) ، والتي تستخدم هدفا واحدا لكل من مجموعة الإثارة والانبعاثات. نصف وظيفة كل مكون من مكونات SOLS بتفاصيل كافية للسماح للقراء بتعديل الأجهزة وتصميمها لتناسب احتياجاتهم الخاصة. أخيرا ، نوضح استخدام أداة SOLS المخصصة هذه من خلال تصور زهور النجمة في شبكات الأنابيب الدقيقة التي يحركها كينيسين.

Introduction

يمثل الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) عائلة من تقنيات التصوير الفلوري عالية الدقة التي يتشكل فيها ضوء الإثارة في ورقة ^1,2 ، بما في ذلك مجهر الإضاءة المستوية الانتقائية (SPIM) ، والإثارة المستوية المحاذية للخلط (SCAPE) ، والمجهر المائل المستوى (OPM)^{3،4،5،6،7}. على عكس طرق الفحص المجهري الأخرى مثل التألق الوبائي ، أو الفحص المجهري الفلوري الداخلي الكلي (TIRFM) ، أو الفحص المجهري متحد البؤر ، تكون السمية الضوئية ضئيلة في LSFM ويمكن تصوير العينات على مدى فترات زمنية أطول لأن مستوى العينة التي يتم تصويرها بنشاط فقط هو المضاء^8،9،10. لذلك ، تعد تقنيات LSFM مفيدة للغاية لتصوير عينات 3D على مدى فترات زمنية طويلة ، ولا سيما تلك السميكة جدا لتقنيات الفحص المجهري متحد البؤر. بسبب هذه الأسباب ، منذ تطويره الأصلي في عام 2004 ، أصبح LSFM تقنية التصوير المفضلة للعديد من علماء الفسيولوجيا وعلماء الأحياء التنموية وعلماء الأعصاب لتصور الكائنات الحية بأكملها مثل الزرد الحي وأجنة ذبابة الفاكهة ^3،4،6،11. في هذين العقدين الماضيين ، تم الاستفادة من مزايا LSFM لتصور البنية والديناميكيات على نطاقات أصغر تدريجيا ، بما في ذلك الأنسجة^11،12 ، والمقاييس الخلوية ، والخلوية ، سواء في الجسم الحي أو في المختبر^{13،14،15،17}.

على الرغم من تقارير حالات الاستخدام الناجحة في الأدبيات ، فإن التكلفة العالية لأنظمة LSFM التجارية (~ 0.25 مليون دولار أمريكي حتى وقت كتابة هذا التقرير)^18,19 تمنع الاستخدام الواسع النطاق لهذه التقنية. لجعل تصميمات DIY بديلا مجديا للباحثين ، تم نشر أدلة بناء متعددة^{8،13،20،21} ، بما في ذلك جهد الوصول المفتوح OpenSPIM²². ومع ذلك ، حتى الآن ، يمكن للباحثين الذين لديهم الحد الأدنى من الخبرة البصرية استخدام تصميمات LSFM السابقة فقط ، والتي لا تتوافق مع العينات التقليدية المثبتة على الشرائح (الشكل 1 أ). يستخدم التنفيذ الأخير للورقة الخفيفة (SOLS) هدفا واحدا لكل من الإثارة والكشف (الشكل 1C) ، وبالتالي التغلب على القيود المتعلقة بالتوافق^{5،6،8،13،20}. ومع ذلك ، فإن تكلفة تعدد استخدامات تصميم SOLS هي زيادة كبيرة في تعقيد البناء بسبب متطلبات هدفين إضافيين لترحيل مستوى الكائن وإزالة إمالته وإعادة تصويره على الكاميرا للتصوير (الشكل 1D). لتسهيل الوصول إلى الإعدادات المعقدة على غرار SOLS ، تقدم هذه الورقة دليلا تفصيليا حول تصميم وبناء وعملية محاذاة واستخدام نظام SOLS المتوافق مع الشرائح ، والذي سيكون مفيدا للباحثين الذين لديهم معرفة بدورة بصريات للمبتدئين فقط.

على الرغم من أن البروتوكول نفسه موجز ، يجب على القراء الرجوع إلى موارد أخرى أثناء خطوات الإعداد لمعرفة المزيد حول أجزاء معينة من اعتبارات التصميم أو الأجهزة. ومع ذلك ، إذا كان القارئ ينوي اتباع مواصفات هذا التصميم ، فقد لا يكون من الضروري فهم كيفية اختيار مكونات بصرية معينة.

الشكل 1: خصائص تكوينات LSFM المختلفة. (أ) الإعداد بهدفين متعامدين شائعين في تصميمات LSFM المبكرة. في هذا التكوين ، يتم استخدام أنبوب شعري أو أسطوانة من الجل لاحتواء العينة ، وهو أمر غير متوافق مع تقنيات تركيب الشريحة التقليدية. (ب) رسم تخطيطي لتصميم ورقة ضوئية SOLS يوضح ما يلي: (ج) الهدف الوحيد المستخدم لكل من الإثارة وجمع الانبعاثات في مستوى العينة (O1) ؛ يسمح ذلك بتركيب شريحة تقليدية في الأعلى ، و (د) نظام هدف الترحيل في مسار انبعاث SOLS. يجمع O2 ضوء الانبعاث ويزيل تكبير الصورة. يقوم O3 بتصوير المستوى بزاوية الميل الصحيحة على مستشعر الكاميرا. الاختصارات: LSFM = المجهر الفلوري للصفائح الضوئية ؛ SOLS = ورقة ضوء أحادية الهدف ؛ O1-O3 = الأهداف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1. التحضير للمحاذاة قبل البدء في الإنشاء ، قم بإجراء أي مراجعات ضرورية للأدبيات للحصول على فكرة واضحة عن حالة الاستخدام المقصودة (على سبيل المثال ، الفلوروفورات المراد تصويرها ، وحجم التصوير الضروري ، ومتطلبات الدقة). على وجه الخصوص ، راجع قسم النتائج التمثيلية أدناه لتحديد ما إذا كان اتباع التصميم الدقيق الموضح هنا مناسبا. إذا كان الأمر كذلك ، فانتقل إلى الخطوة 1.2. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فابحث عن اقتراحات وإرشادات لاختيار الأجهزة في دليل بناء Sheunglab SOLS23.ملاحظة: يمكن للمستخدم العثور على مزيد من المعلومات حول مواصفات هذا النظام المحدد في قسم المناقشة. اجمع كل المكونات البصرية والبصرية والكهربائية الضرورية كما هو مفصل في جدول المواد. بالنسبة للمستخدمين الذين يقومون بتعديل النظام ، اجمع كل الأجزاء المكافئة. قم ببناء ليزر المحاذاة كما هو موضح في الشكل 2 أ. تأكد من أن الحزمة متوازية باستخدام لوحة القص. قم ببناء قفص محاذاة القرص الزجاجي المصنفر المزدوج كما هو موضح في الشكل 2 ب. تحضير عينة اختبار الصبغة المطلية بالفلورسنت.قم بإنشاء محلول صبغة رودامين مشبع عن طريق إضافة 1 مل من الماء المقطر تدريجيا إلى 0.2 غرام من المسحوق المجفف بالتجميد حتى يذوب بالكامل. دوامة للتجانس.ملاحظة: هذا الحل حساس للضوء. على الرغم من عدم وجود الاحتياطات اللازمة أثناء التحضير ، تأكد من تخزين المحلول في منطقة مظلمة بعد تحضيره.تنبيه: احرص دائما على ارتداء القفازات والقناع عند التعامل مع مسحوق الرودامين. ماصة 10 ميكرولتر على وسط شريحة اختبار. ضع غطاء زجاجي مقاس 22 مم × 22 مم فوق السائل ، مما يضمن أن طبقة التألق رقيقة قدر الإمكان. ختم مع طلاء الأظافر واضحة.ملاحظة: هذه العينة حساسة للضوء. لزيادة عمر العينة، تأكد من تخزين الشريحة في منطقة مظلمة عندما لا تكون قيد الاستخدام. تحضير عينة حبة 3D (1 ميكرومتر الخرز جزءا لا يتجزأ من هلام).استخدم شريطا على الوجهين لإنشاء قناة رأسية بعرض 4-5 مم على شريحة عينة بثلاث طبقات من الشريط بارتفاع. ضع غطاء زجاجي مقاس 22 مم × 22 مم أعلى الشريط في وسط الشريحة. اضغط بقوة على المناطق المسجلة لضمان إحكام الإغلاق الجيد بين الشريط وزجاج الغطاء. استخدم شفرة حلاقة لإزالة الشريط الزائد. تحضير 125 مل من محلول صمغ جيلان المشبع عن طريق إضافة ماء DI تدريجيا إلى 1 غرام من مسحوق صمغ جيلان. سيكون هذا المحلول صلبا في درجة حرارة الغرفة سائلا عند 65 درجة مئوية. أدخل 1 مل من محلول صمغ جيلان في أنبوب طرد مركزي دقيق. سخني وعاء من الماء على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية ، وقم بتسخين أنبوب الطرد المركزي الدقيق حتى يصبح صمغ جيلان لزجا بشكل واضح. تحضير 10 ميكرولتر من تخفيف 1: 1000 من الخرز في محلول صمغ جيلان دافئ. ماصة بعناية الحل في الغرفة حتى ممتلئة. استخدم عود أسنان لمسح كمية صغيرة من الإيبوكسي على جانبي القناة ، مع تغطية الفتحات بالكامل لإغلاقها. لضمان الختم المناسب ، افحص كلا الطرفين بصريا للتأكد من أن الإيبوكسي قد اخترق قليلا كل طرف من طرفي القناة. الشكل 2: صور لأدوات المحاذاة. أ: ليزر المحاذاة المتوازية. AL1: عدسة المحاذاة 1 ، −50 مم ؛ AL2: عدسة المحاذاة 2 ، 100 مم (B) قفص محاذاة قرص زجاجي بلوري مزدوج. الاختصارات: RMS CP = لوحة قفص ملولبة RMS ؛ SM1 CP = SM1 لوحة قفص ملولبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 2. محاذاة مسار الإثارة ارسم تخطيط المجهر على سطح الطاولة البصرية. قياس جميع المسافات بأكبر قدر ممكن من الدقة.ملاحظة: راجع الشكل 3 لمعرفة موقع المكونات داخل النظام. قم بتركيب ليزر الإثارة على الطاولة. اضبط قزحيتين على الارتفاع المقصود لليزر ، وقم بتركيبهما على بعد 2-3 أقدام على خط الثقوب المطلوب خلف موقع المرآة 1 (M1). استخدم هذه القزحية للتأكد من أن الحزمة مستوية مع سطح الطاولة ومركزة على خط الثقوب على الطاولة البصرية.ملاحظة: ارتد نظارات واقية من الليزر لحماية العين ، وقم بسد أي أشعة ليزر طائشة مزودة بشاشات أمان ليزر كإجراء احترازي للسلامة. حتى يتم تثبيت جميع المكونات بشكل دائم ، يكون الانجراف في ترتيب الساعات ممكنا. قم بإعداد قزحية في أبعد نقطة من المحاذاة في نهاية كل يوم كفحص بصري سريع للانجراف عند العودة إلى البناء. الاهتزازات ، والجدول البصري العائم بشكل غير صحيح ، والتيارات الهوائية هي الأسباب الأكثر شيوعا للانجراف البصري. قم بتركيب مصراع الليزر في أقرب مكان ممكن من ليزر الإثارة. استخدم هذا الغالق لحجب ضوء الليزر بسرعة أثناء المحاذاة ، بدلا من تشغيل الليزر وإيقاف تشغيله بشكل متكرر. قم بتجميع مرشحات الكثافة المحايدة في عجلة مرشح الكثافة المحايدة (الكثافة المحايدة 0.5، 1.0، 2.0، 3.0، 4.0، وفتحة فارغة)، وقم بتركيبها بعد غالق الليزر. قم بتبديل المشغل الميكانيكي إلى مرحلة ترجمة واحدة (TS1) ، ثم أدخل المرحلة أسفل موقع M1. تأكد من أن المرحلة تترجم محوريا على طول نفس خط الثقوب الذي يتبعه ضوء الليزر. اضبط المرحلة في منتصف نطاقها للموضع الأولي.في الخطوات التالية 2.6-2.10 ، أدخل المكونات البصرية العاكسة في مسار الحزمة واحدا تلو الآخر لتوجيه الليزر على طول المسار كما هو مرسوم على الطاولة. استخدم زوج القزحية المضبوط على الارتفاع الدقيق لتحديد مسار شعاع الخروج المطلوب وتوجيه موضع ومحاذاة كل عنصر عاكس. لكل عنصر ، اضبط ارتفاع وموضع الحامل للتأكد من أن الحزمة الواردة تصل إلى المركز. بعد ذلك ، قم بتدوير قاعدة الحامل لتوجيه الشعاع على طول مسار الشعاع الممتد على الطاولة بحيث يمر عبر كلتا القزحيتين ، واضبط إمالة الحزمة الصادرة بدقة باستخدام المقابض الموجودة في الجزء الخلفي من كل حامل.ملاحظة: بعد محاذاة كل عنصر إلى الارتفاع الصحيح ، أضف طوقا سهل الارتداء إلى العمود لتأمين الارتفاع. قم بتركيب ومحاذاة M1 أعلى TS1. قم بتركيب ومحاذاة ثنائي اللون على الطاولة. باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، قم بتوصيل galvo بمصدر الطاقة ومولد الوظيفة. قم بتركيب galvo بحيث يسقط الليزر على المركز الدقيق للمرآة. قم بتشغيل galvo ، ثم اضغط مع الاستمرار على زر AM على مولد الشكل الموجي لضبط إمالة المرآة على تيار مستمر 0 فولت (مركز النطاق). الآن ، قم بمحاذاة galvo إلى القزحية. قم بتركيب ومحاذاة المرآة 2 (M2). أدخل المرآة الأسطوانية الكبيرة في حامل المرآة الأسطواني. استخدم 1 في قضبان القفص لتوصيل محول قفص 30-60 مم فوق المرآة 3 (M3). استخدم المقابض الموجودة على حامل المرآة لتسطيح إمالة مرآة M3 للوضع الأولي. قم بتركيب قفص المحاذاة الزجاجي المزدوج في محول القفص فوق M3 ؛ تأكد من إحكام ربط البراغي المحددة على محول القفص التي تثبت قفص المحاذاة في مكانه في كل مرة يتم استخدامه للمحاذاة. قم بتركيب M3 على الطاولة ، واضبط الارتفاع والموضع حتى يتم توسيط الحزمة تقريبا على كل من أقراص محاذاة الزجاج المصنفر. قم بتثبيت M3 على الطاولة ، واستخدم حامل عمود ، 3 في العمود ، ومشبك 90 درجة ، و 2 في العمود على جانبي M3 لإضافة الدعم باستخدام الثقوب المسجلة على جانبي حامل المرآة. استخدم المقابض الموجودة على الجزء الخلفي من المرآة لضبط الشعاع بدقة.ملاحظة: تم الآن تعيين جميع العناصر العاكسة في مسار الإثارة ويجب عدم لمسها. قم بتركيب العدسة 1 (L1) على الطاولة. بالنسبة لجميع مواضع العدسة الأولية ، استخدم هدفا للعدسة اللولبية لتوسيط الحزمة الواردة في مقدمة العدسة. اضبط الإمالة والموضع الجانبي للعدسة 1 (L1) حتى يتم توسيط الشعاع على كل من الألواح الزجاجية المصنفرة على قفص المحاذاة فوق M3. جبل عدسة 2 (L2) في موقعها الخاص لإنشاء نظام 4f مع L1. حرك L2 محوريا للحصول على شعاع متوازي ، واستخدم ليزر الإثارة ولوحة القص للتحقق من الموازاة. اضبط الإمالة والموضع الجانبي ل L2 لتوسيط الحزمة على كل من الأقراص الزجاجية المصنفرة فوق M3. قم بتركيب الثقب في حامل ترجمة xy. قم بتثبيت هذا فوق مرحلة الترجمة 1D لتوفير ترجمة محورية دقيقة. قم بتركيب الثقب والمسرح على عمود وحامل آخر ، وضعه في النقطة البؤرية المشتركة بين L1 و L2. اضبط الثقب يدويا حتى يمكن رؤية ضوء الليزر من خلال الثقب. قم بتركيب مستشعر عداد الطاقة مباشرة بعد الثقب ، واستخدم زر الطول الموجي على وحدة التحكم الرقمية لمقياس الطاقة لتحديد الطول الموجي لليزر الإثارة. اضبط موضع xy للثقب لزيادة الإرسال إلى أقصى حد والحصول على ملف تعريف شعاع TEM00 قريب. بعد ذلك ، اضبط الثقب محوريا مع مرحلة 1D لزيادة الإرسال. قم بتركيب Lens 4 (L4) على الطاولة في موضعها ، واضبط الحامل على الارتفاع الصحيح. اضبط L4 محوريا بحيث يركز شعاع الإثارة على سطح galvo. اضبط الإمالة والموضع الجانبي ل L4 لتوسيط الحزمة على كل من الأقراص الزجاجية المصنفرة فوق M3. قم بتركيب العدسة 3 (L3) على الطاولة في موضعها ، واضبط الحامل على الارتفاع الصحيح. استخدم ليزر الإثارة ولوحة القص للتحقق من موازاة L3 و L4. اضبط الإمالة والموضع الجانبي ل L3 لتوسيط الحزمة على كل من الأقراص الزجاجية المصنفرة فوق M3. قم بإزالة L3 مؤقتا. قم بتركيب عدسة المسح الضوئي 1 (SL1) على الطاولة ، واضبط المسافة المحورية لتشكيل تلسكوب متوازي مع L4 ، كما تم قياسه باستخدام لوحة القص. اضبط الإمالة والموضع الجانبي ل SL1 لتوسيط الشعاع على كل من الأقراص الزجاجية المصنفرة فوق M3. أعد إدراج L3. عدسة أنبوب التركيب 1 (TL1) ، واستخدم شعاع الإثارة ولوحة القص لموازنة SL1 و TL1. اضبط الإمالة والموضع الجانبي ل TL1 لتوسيط الحزمة على كل من الأقراص الزجاجية المصنفرة فوق M3. باستخدام حلقة محول ، قم بربط الهدف 1 (O1) في لوحة القفص فوق M3. قم بإزالة SL1 مؤقتا ، واترك الشعاع يضرب السقف. اضبط الارتفاع (المسافة المحورية) ل O1 على نظام القفص حتى تشكل الحزمة قرصا متجدد الهواء على السقف ، ثم استمر في الضبط حتى يتم تقليل حجم القرص. مع وجود O1 في مكانه ، قم بتركيب مرحلة العينة في الموضع المناسب. الشكل 3: موقع المكونات داخل نظام SOLS. (أ) التخطيط التخطيطي لنظام SOLS مع تسمية جميع المكونات. (ب) صورة من أعلى لأسفل لنظام SOLS المادي على الطاولة البصرية ، باستثناء منطقة مرحلة العينة. (ج) صورة من أعلى إلى أسفل لمنطقة مرحلة العينة (امتداد إلى الشكل 3B). يظهر مسار الإثارة باللون الأخضر. مسار الانبعاث موضح باللون الأحمر. الأطوال البؤرية للعدسات: L1: 100 مم ؛ L2: 45 مم ؛ CL1: 50 مم ؛ CL2: 200 مم ؛ CL3: 100 مم ؛ L3: 150 مم ؛ L4: 100 مم ؛ SL1: 75 مم ؛ TL1: 200 مم ؛ SL2: 150 مم ؛ TL2: 125 مم ؛ TL3: 200 مم. انظر جدول المواد للحصول على مواصفات أكثر تفصيلا للأجزاء. الاختصارات: SOLS = ورقة ضوء أحادية الهدف ؛ عجلة ND = عجلة تصفية متغيرة الكثافة المحايدة ؛ L1-L4 = عدسات كرومات مقعرة بلانو ؛ CL1-CL3 = عدسات أسطوانية ؛ M1-M3 = المرايا ؛ TS1-TS2 = مراحل الترجمة؛ DM = مرآة ثنائية اللون ؛ Galvo = مسح الجلفانومتر ؛ SL1-SL2 = عدسات المسح الضوئي ؛ TL1-TL2 = العدسات الأنبوبية ؛ O1-O3 = الأهداف؛ EF = مرشح الانبعاثات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 3. محاذاة مسار الانبعاث قم بإعداد ليزر المحاذاة.قم بتركيب لوحين قفصيين فارغين بجانب ليزر الإثارة على نفس ارتفاع الليزر. استخدم ألواح القفص هذه لتركيب ليزر المحاذاة عن طريق تحريك قضبان القفص الخاصة بليزر المحاذاة في الثقوب الفارغة في لوحي القفص. تأكد من إمكانية ضبط الليزر على وضع التشغيل ، إما عن طريق النقر حول زر الطاقة أو عن طريق توصيل مفتاح تشغيل / إيقاف. قم بإزالة O1 ، وأعد إدخال قفص المحاذاة الزجاجي المصنفر. استخدم حامل مرآة حركيا واحدا ومرآة منسدلة واحدة لمحاذاة شعاع المحاذاة إلى مسار شعاع الإثارة. استخدم مقياس الطاقة لزيادة إشارة شعاع المحاذاة إلى أقصى حد بعد الثقب عن طريق ضبط المرآتين بدقة. تأكد من أن الشعاع يظل متمركزا على قفص محاذاة الزجاج المصنفر. قم بإزالة قفص المحاذاة، وأعد إدخال O1. ضع المرآة المربعة على مرحلة عينة O1 ، واضبط المرآة محوريا حتى يتم تقليل حجم ملف تعريف الحزمة بعد ثنائي اللون. قم بتركيب قزحية واحدة في مسار الانبعاث وبعيدا بما يكفي للخلف بحيث يمكن إدخال عدسة المسح الضوئي 2 (SL2) وعدسة الأنبوب 2 (TL2) والهدف 2 (O2) دون تداخل. قم بمحاذاة هذه القزحية مع ليزر المحاذاة. قم بتركيب قرص زجاجي بلوري على الأقل 1 بوصة خلف القزحية ، وتأكد من محاذاة هذا أيضا مع ضوء الليزر. أدخل SL2 على المسافة الصحيحة ، كما تم قياسها من galvo باستخدام المسطرة. اضبط الإمالة والموضع الجانبي ل SL2 بحيث يتم توسيط شعاع المحاذاة الوارد على SL2 ويمر الشعاع الصادر عبر القزحية والقرص الزجاجي المصنفر. أدخل TL2 على المسافة الصحيحة، كما تم قياسها من SL2 باستخدام مسطرة. اضبط الإمالة والموضع الجانبي ل TL2 بحيث يتم توسيط شعاع المحاذاة الوارد على TL2 ويمر الشعاع الصادر عبر القزحية والقرص الزجاجي المصنفر. قم بتركيب TS2 على الطاولة. تأكد من أن المرحلة تترجم على طول المحور البصري ل O2. قم بربط O2 على حامل ترجمة xy. قم بتوصيل منشور أسفل حامل xy لتركيب O2 على مرحلة الترجمة. استخدم هدفا لولبيا لتوسيط الجزء الخلفي من O2 على الليزر الأحمر. اضبط مقابض xy وإمالة O2 بحيث يمر شعاع المحاذاة الأحمر عبر القزحية والقرص الزجاجي المصنفر. حرك ليزر المحاذاة إلى أعلى O1 ووجهه لأسفل إلى مسار الانبعاث. قم بتشغيل الليزر ، وتأكد من توسيط هذا الشعاع على جميع العدسات في مسار الانبعاث. اقترن بمستويات التلميذ ل O1 و O2 عن طريق فتح القزحية وإزالة القرص الزجاجي المصنفر بحيث يستمر شعاع المحاذاة الخارج من O2 دون عائق إلى سطح أو جدار بعيد (>0.5 م) (الشكل 4). اضبط TS2 حتى يشكل الشعاع قرصا صغيرا متجدد الهواء على السطح ، ثم استمر في ضبط TS2 لتقليل حجم قرص Airy.ملاحظة: يشير شعاع متباعد بشدة إلى وضع O2 بشكل غير صحيح. ومع ذلك ، نظرا لأن هذا الشعاع يمر عبر هدفين ، فإن قدرا صغيرا من الاختلاف متأصل. على هذا النحو ، فإن قرص Airy هو أفضل دليل. تحسين galvo للمسح الثابت للإمالة: اضغط على زر FSK على مولد الشكل الموجي لتحديد إشارة موجة مثلثة ل galvo ، واضبطها على تردد منخفض (~ 1 هرتز). راقب شعاع المحاذاة على نفس السطح أو الجدار البعيد.ملاحظة: إذا تم وضع galvo بشكل غير صحيح ، فسوف يكتسح الشعاع أفقيا على السطح مع حركة galvo. يمكن حل ذلك من خلال التعديلات الدقيقة (يدويا) للإمالة وموضع xy لقاعدة galvo حتى لا يمكن اكتشاف إزاحة الحزمة بالعين. تحقق من جودة النظام عن طريق التصوير عند 0 درجة.المسمار O3 في حامل الترجمة xy. قم بربط أنبوب عدسة 1 بوصة في مرحلة ترجمة القفص ، وقم بربط مرحلة الترجمة xy في الأنبوب. استخدم قضيبين قفصيين لتوصيل الجزء الأمامي من مرحلة ترجمة القفص بلوحة قفص ، وقم بتركيب لوحة القفص على عمود. قم بتركيب الهدف 3 (O3) بالقرب من مقدمة O2 (~ 4-5 مم) عند 0 درجة ، واضبط الارتفاع لمطابقته. قم بتركيب قرص محاذاة زجاجي بلوري في المستوى البؤري المشترك بين SL2 و TL2 ، كما تم قياسه باستخدام مسطرة. قم بتركيب شريحة اختبار الفلورسنت الأكريليك على المسرح ، وقم بإضاءة الشريحة باستخدام ليزر الإثارة. انظر من خلال الجزء الخلفي من O3 ، واضبط كلا من الارتفاع والموضع المحوري ل O3 للعثور على ضوء الانبعاث ، ثم اضبط O3 محوريا حتى يملأ ضوء الانبعاث الفتحة الخلفية (الشكل 5). المسمار اثنين 8 في قضبان قفص في الجزء الخلفي من مرحلة الترجمة O3. حرك لوحة قفص مع قرص زجاجي بلوري مثبت على القضبان ، ثم اضبط O3 جيدا باستخدام حامل xy للتأكد من خروج ضوء الانبعاث من O3 في المنتصف. ثم قم بإزالة قضبان القفص. قم بتركيب قرص زجاجي بلوري في الموضع الخشن لمستشعر الكاميرا ، وقم بمحاذاة ارتفاع القرص وموضعه مع ضوء الانبعاث. قم بتركيب عدسة الأنبوب اللولبي 3 (TL3) في لوحة قفص ، وقم بتركيبها خلف O3 مباشرة. قم بتوسيط TL3 على ضوء الانبعاث الوارد ، ثم اضبط إمالة TL3 لمحاذاة الضوء الصادر إلى القرص الزجاجي المصنفر. قم بتركيب الكاميرا على المسافة الصحيحة من العدسة الأنبوبية ، كما تم قياسها باستخدام المسطرة. المسمار على حد سواء 2 في أنابيب العدسة ومرشح الانبعاث على الكاميرا. أعد تركيب قرص محاذاة الزجاج المصنفر في المستوى البؤري المشترك بين SL2 و TL2. قم بتركيب عينة اختبار صبغة الفلورسنت ، وأضيء العينة بحزمة الإثارة. قم بتشغيل الكاميرا ، ثم افتح برنامج Micromanager على الكمبيوتر المتصل. انقر فوق Live للدخول إلى العرض المباشر. انقر فوق Auto Once لضبط إعدادات التعرض الأولية ، ثم أعد تعيين التعرض حسب الضرورة عند التصوير.ملاحظة: لن يعمل Micromanager بشكل صحيح ما لم يتم فتحه بعد تشغيل الكاميرا. اضبط مقابض الترجمة xy على حامل O3 حتى يتم توسيط الفتحة الصغيرة في قرص محاذاة الزجاج داخل مجال الرؤية (FoV). اضبط O3 محوريا مع مرحلة ترجمة القفص حتى يتم التركيز على الفتحة ؛ يجب أن تظهر الحواف حادة (الشكل 6). صورة حبات الفلورسنت للتحقق من جودة النظام. قم بإزالة قرص محاذاة الزجاج المصنفر ، وقم بتركيب عينة حبة 3D ، وأضيء العينة بشعاع الإثارة. اضبط ارتفاع العينة بالنسبة إلى O1 حتى تملأ حبات الفلورسنت منطقة دائرية في وسط FoV. اضبط موضع O3 باستخدام المرحلة xy ومرحلة الترجمة المحورية حتى تكون وظائف انتشار النقطة (PSFs) مستديرة (تدل على الحد الأدنى من الانحرافات) وساطعة (تدل على نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة) (الشكل 7). إذا تعذر تحقيق ذلك عن طريق ضبط O3 ، فمن المحتمل جدا أن يكون النظام البصري بين المكونات O1 و O2 محاذيا دون المستوى الأمثل ؛ اتبع الفحوصات التشخيصية في الخطوة 3.13 أدناه. إذا كان من الممكن الحصول على PSFs مستديرة ، فتخط خطوة التشخيص ، وانتقل إلى إمالة نظام التصوير. قم بإجراء فحوصات تشخيصية إذا لزم الأمر.ملاحظة: بمجرد الحصول على PSFs جيدة ، يمكن تخطي بقية خطوات التشخيص.قم بتركيب ضوء برايتفيلد (BF) فوق O1. قم بتركيب هدف اختبار الشبكة الإيجابي على مرحلة العينة بنفس الارتفاع المحوري مثل مرآة المحاذاة. قم بتوسيط الشبكة 10 ميكرومتر ، وقم بإضاءة الشبكة بضوء BF. قم بتصوير الشبكة على الكاميرا ، وترجم العينة حتى يتم التركيز على الشبكة. استخدم صورة الشبكة للتأكد من أن الحقل عبر FoV مسطح: إذا لم يكن الأمر كذلك ، فستظهر الشبكة مشوهة ومنحنية. لتصحيح صورة شبكة سيئة ، اضبط موضع xyz وإمالة O3 ، ثم اضبط TL3 والكاميرا وفقا لذلك.ملاحظة: إذا كان من الممكن تحقيق شبكة مسطحة، كرر الخطوة 3.12.10، ثم انتقل إلى إمالة نظام التصوير. قم بإعداد كاميرا المحاذاة أو كاميرا التصوير على المسافة الصحيحة بحيث يركز SL2 الصورة على المستشعر. تخيل هدف الشبكة عند المستوى المتوسط (الشكل 8). إذا كانت هذه الشبكة منحرفة أيضا ، فمن المحتمل جدا أن يكون النظام البصري بين المكونين O1 و SL2 محاذيا دون المستوى الأمثل ويجب إعادة النظر فيه. قم بتحسين المحاذاة حسب الضرورة قبل التقدم.ملاحظة: إذا لم تكن الكاميرا مناسبة بين SL2 وTL2، فاستخدم مرآة إضافية لترتد الصورة بزاوية 90 درجة بعد SL2 وعلى الكاميرا. تحقق من PSFs في المستوى المتوسط: بعد التحقق من الشبكة ، هناك فحص تشخيصي جيد آخر وهو التحقق من PSFs في نفس المستوى المتوسط. تشير الصورة الجيدة في هذا المستوى ، والتي تشبه الشكل 7 ولكن بتكبير مختلف (الشكل 9) ، إلى محاذاة جيدة من خلال SL2.ملاحظة: إذا كان من الممكن تحقيق شبكة مسطحة و PSFs مستديرة في المستوى المتوسط ، كرر الخطوة 3.13.2 ، ثم الخطوة 3.12.10 ، ثم انتقل إلى إمالة نظام التصوير. قم بإمالة نظام التصوير الفرعي O3 إلى 30 درجة.قم بإزالة O3 و TL3 والكاميرا. أعد إدخال O3 عند 30 درجة إلى المحور الأصلي ل O2 باستخدام الخطوط الموجودة على الطاولة كدليل. قم بتركيب قرص محاذاة زجاجي بلوري في المستوى البؤري المشترك بين SL2 و TL2. قم بتركيب شريحة اختبار الفلورسنت الأكريليك على المسرح ، وقم بإضاءة الشريحة باستخدام ليزر الإثارة. مرة أخرى ، انظر من خلال الجزء الخلفي من O3 ، واضبط كلا من الارتفاع والموضع المحوري ل O3 للعثور على ضوء الانبعاث عند 30 درجة ، ثم اضبط O3 محوريا حتى يملأ ضوء الانبعاث الفتحة الخلفية. قم بإزالة قرص محاذاة الزجاج المصنفر من بين SL2 و TL2 للحصول على إشارة انبعاث أقوى. المسمار اثنين 8 في قضبان قفص في الجزء الخلفي من مرحلة الترجمة O3. حرك لوحة قفص مع قرص زجاجي بلوري مثبت على القضبان ، ثم اضبط O3 جيدا باستخدام حامل xy للتأكد من خروج ضوء الانبعاث من O3 في المنتصف. ثم قم بإزالة قضبان القفص. قم بتركيب قرص زجاجي بلوري في الموضع الخشن لمستشعر الكاميرا ، وقم بمحاذاة ارتفاع القرص وموضعه مع ضوء الانبعاث. جبل TL3 مباشرة خلف O3. قم بتوسيط TL3 على ضوء الانبعاث الوارد ، ثم اضبط إمالة TL3 لمحاذاة الضوء الصادر إلى القرص الزجاجي المصنفر. لضبط مسافة كاميرا TL3 بدقة أكبر ، قم بفك O3 بعناية ، وقم بتركيب ليزر المحاذاة بحيث يتم تركيزه بواسطة TL3 على الكاميرا. استخدم مرشحات ND حسب الضرورة بحيث تكون شدة الليزر <1 ميجاوات. ابدأ العرض المباشر للكاميرا، واضبط TL3 محوريا لتقليل بقعة الليزر على الكاميرا. أعد تركيب قرص محاذاة الزجاج المصنفر في المستوى البؤري المشترك بين SL2 و TL2. قم بتركيب عينة اختبار صبغة الفلورسنت ، وأضيء العينة بحزمة الإثارة. اضبط مقابض الترجمة xy على حامل O3 حتى يصبح الثقب الصغير في قرص محاذاة الزجاج داخل FoV على الكاميرا. اضبط مرحلة ترجمة القفص لتحريك O3 محوريا حتى يتم التركيز على الفتحة ؛ تأكد من أن الثقب يبدو مشابها لما كان عليه عند 0 درجة. أعد تركيب هدف اختبار الشبكة الإيجابي على نفس الارتفاع المحوري ، وقم بإضاءة الشبكة بضوء BF. تأكد من وجود قسم رأسي واحد فقط قيد التركيز (بسبب الإمالة بمقدار 30 درجة). مرة أخرى ، استخدم صورة الشبكة لتأكيد أن الحقل عبر FoV مسطح ، حتى عندما يكون خارج نطاق التركيز. عندما تتم ترجمة الشريحة محوريا ، تأكد من أن الجزء البؤري من FoV (هدف الشبكة) يكتسح الشاشة أفقيا ، بينما تحافظ مربعات الشبكة على حجم ثابت (الشكل 10).ملاحظة: نظرا لميل مستوى التصوير عند العينة، قد تظهر الشبكة ممتدة قليلا في المستوى x. الشكل 4: تقنية الليزر داخل الليزر. إرسال شعاع اختبار متوازي عبر مقدمة O1 ومراقبة الحزمة التي تخرج من O2 على سطح بعيد. إذا تمت محاذاة جميع المكونات على المسافة الصحيحة ، فستشكل الحزمة قرصا صغيرا متجدد الهواء على السطح البعيد. جميع الاختصارات هي نفسها كما في الشكل 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: استخدام ضوء الانبعاث للمحاذاة. (أ) انبعاث ضوء من شريحة فلورية أكريليك على هدف لولبي خلف BFP ل O2. ب: إيجاد ضوء الانبعاث عن طريق البصر من خلال الجزء الخلفي من O3. الاختصارات: O2-O3 = الأهداف ؛ BFP = المستوى البؤري الخلفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: صورة على الكاميرا لقرص محاذاة الزجاج المصنفر المركز بشكل صحيح. تم وضع القرص في المستوى الوسيط بين SL2 و TL2. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: SL2 = عدسة المسح الضوئي ؛ TL2 = عدسة أنبوبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 7: صورة الكاميرا لعينة حبة 3D. تظهر الصورة حبات 1 نانومتر مع ضبط وحدة التصوير على 0 درجة ومضاءة بواسطة شعاع دائري قبل إدخال العدسات الأسطوانية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 8: هدف اختبار الشبكة الإيجابي يركز بشكل صحيح على المستوى الوسيط بين SL2 و TL2. تشير الشبكات المسطحة في جميع أنحاء الحقل بأكمله إلى محاذاة جيدة للمكونات SL2 وما قبلها. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. الاختصارات: SL2 = عدسة المسح الضوئي ؛ TL2 = عدسة أنبوبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 9: صورة الكاميرا لعينة حبة 3D. تظهر الصورة حبات 1 نانومتر مركزة بشكل صحيح على المستوى الوسيط بين SL2 و TL2. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. الاختصارات: SL2 = عدسة المسح الضوئي ؛ TL2 = عدسة أنبوبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 10: هدف اختبار الشبكة الإيجابي مع مربع أصفر بحجم ثابت متراكب لمطابقة مربعات الشبكة. (أ) تركيز الشبكة على الجانب الأيسر. (ب) الشبكة في التركيز على الطرف الأيمن. يتطابق المربع الأصفر مع حجم مربعات الشبكة على جانبي FoV. أشرطة المقياس = 30 ميكرومتر. اختصار = FoV = مجال الرؤية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 4. محاذاة ورقة الضوء المائل قم بإزالة O1 ، وأعد إدخال قفص المحاذاة الزجاجي المزدوج في مكانه. تأكد من أن الحزمة متوازية ومتمركزة على كلا القرصين الزجاجيين المصنفرين. قم بربط العدسة الأسطوانية اللولبية 1 (CL1) في حامل عدسة دوار. قم بتركيب CL1 في المسار البصري ، وقم بتدوير الحامل بحيث يتم توسيع الحزمة في الاتجاه الرأسي إلى الجدول البصري. اضبط الإمالة والموضع الجانبي ل CL1 بحيث يتم توسيط الحزمة في المقدمة وتحافظ على وضع مركزي على كل من الأقراص الزجاجية المصنفرة. قم بربط العدسة الأسطوانية اللولبية 2 (CL2) في حامل عدسة دوارة ، وقم بتركيب CL2 في المسار البصري على المسافة الصحيحة لتشكيل نظام 4f مع CL1. قم بتدوير CL2 إلى نفس اتجاه CL1 بحيث يتم تمديد الحزمة في الاتجاه الرأسي إلى الجدول البصري وموازاتها. استخدم بطاقة اختبار لقياس ارتفاع ملف تعريف الحزمة الأسطوانية في مواقع متعددة للتأكد من أن الحزمة موازية. اضبط الإمالة والموضع الجانبي ل CL2 ، كما هو موضح في الخطوة 4.2. قم بربط العدسة الأسطوانية اللولبية 3 (CL3) في حامل عدسة دوارة ، وقم بتركيب CL3 في المسار البصري على المسافة الصحيحة لتشكيل نظام 4f مع L3. قم بتدوير CL3 إلى نفس اتجاه كل من CL1 و CL2 بحيث يتم تركيز الحزمة لأسفل إلى ملف تعريف أفقي للورقة في المستوى البؤري. اضبط الإمالة والموضع الجانبي ل CL3 ، كما هو موضح في الخطوة 4.2. أدخل الشق: باستخدام أربعة قضبان قفص 4 بوصة وحامل قفص CL3 ، قم بتركيب الشق في اتجاه رأسي عند المستوى البؤري بين CL3 و L3 ، كما تم قياسه بمسطرة. استخدم ملف تعريف شعاع الإثارة الممتد لضبط الارتفاع والموضع الجانبي للشق حتى يتم توسيطه على الحزمة. أعد إدخال O1 ، وقم بتركيب عينة اختبار صبغة الفلورسنت ، وقم بإضاءة العينة بورقة ضوء الإثارة. في مستشعر الكاميرا ، تأكد من ظهور ورقة الضوء 0 درجة كورقة رأسية رفيعة (الشكل 11 أ). قم بإزالة عينة اختبار صبغة الفلورسنت ، وامسح O1 نظيفا. دع ورقة الضوء تتوسع فوق O1 دون عائق. باستخدام التحكم في مرحلة الترجمة الآلية ، قم بترجمة M1 نحو العدسات الأسطوانية لضبط زاوية ورقة الضوء على 60 درجة تقريبا بالنسبة إلى المحور البصري ل O1.ملاحظة: من الأهمية بمكان أن تميل ورقة الضوء في الاتجاه الصحيح لتتماشى مع مستوى التصوير المائل بالمثل (الشكل 12) ؛ إذا تم وضع نظام بشكل مختلف عن هذا التصميم المحدد ، فيمكن معرفة الاتجاه الصحيح للإمالة من خلال تتبع الأشعة الهندسية.ملاحظة: كمرجع، فإن ترجمة M1 2.647 مم باتجاه الشق اضبط ورقة الضوء على الإمالة الصحيحة في هذا الإعداد. أعد إدخال عينة اختبار صبغة الفلورسنت لتصوير الورقة المائلة. تأكد من أن ورقة الضوء قد حافظت على شكل شعاع عمودي على الكاميرا ولكنها أعرض وأكثر خفوتا (الشكل 11B). ترجم العينة محوريا مع المرحلة بحيث تضيء صبغة الفلورسنت بواسطة ورقة الضوء على خمسة أعماق مختلفة بين مركز FoV والجانب الأيمن من الشاشة. احفظ كل صورة. افتح الصور في فيجي. لكل صورة، حدد أداة الخط، وارسم خطا أفقيا من مركز FoV إلى مركز ورقة الضوء. لقياس الإزاحة، انتقل إلى تحليل | قم بالقياس لمعرفة طول الخطوط. بعد ذلك ، ارسم إزاحة ورقة الضوء كدالة لعمق العينة لحساب زاوية ورقة الضوء فوق O1. ترجمة M1 قليلا. كرر الخطوتين 4.9 والخطوة 4.10 حتى تصبح زاوية ورقة الضوء 60 درجة من المحور الأصلي ل O1 ، مطابقة لزاوية مستوى التصوير. الشكل 11: صور الكاميرا لعينة اختبار صبغة الفلورسنت مضاءة بواسطة ورقة ضوئية ذات شكل صحيح. (أ) الورقة عند 90 درجة ، مستقيمة على طول المحور الأصلي ل O1 ، و (ب) مائلة إلى 30 درجة (60 درجة إلى المحور الأصلي ل O1). قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصار: O1 = الهدف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 12: الاتجاه الصحيح لإمالة الصفيحة الضوئية لمحاذاة مستوى التصوير O1. الاختصار: O1-O3 = الأهداف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 5. ضبط نظام التصوير وجمع البيانات قم بتركيب شريحة حبة 3D ، وقم بترجمة العينة محوريا مع المسرح حتى تملأ الحبيبات FoV على الكاميرا. اضبط O3 باستخدام مرحلة xy ومرحلة ترجمة القفص ، بهدف تقليل الانحرافات وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء في الصورة (الشكل 13). اضبط طوق التصحيح ل O1 ، بهدف تقليل الانحرافات وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء في الصورة. الشكل 13: صور الكاميرا لعينة حبة ثلاثية الأبعاد (حبات 1 ميكرومتر) مضاءة بواسطة ورقة ضوئية ذات شكل صحيح. (أ) ورقة عند 90 درجة ، مستقيمة على طول المحور الأصلي ل O1 ، و (ب) مائلة إلى 30 درجة إلى المحور الأصلي ل O1. يشير المربع الأصفر إلى جزء من FoV مسطح ومتسق وقابل للاستخدام (80 ميكرومتر × 80 ميكرومتر) والذي يمكن التقاط بيانات موثوقة فيه. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: O1 = الهدف ؛ FoV = مجال الرؤية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 6. معايرة تكبير النظام قم بتركيب هدف اختبار الشبكة الإيجابي في مرحلة العينة ، وأضيء بضوء برايتفيلد. قم بترجمة شريحة الشبكة محوريا مع المنصة لإبراز شريحة الشبكة في التركيز. اجعل مركز الشبكة في بؤرة التركيز. التقط الصورة واحفظها ، ثم افتحها في فيجي. استخدم أداة الخط ووظيفة القياس في فيجي لقياس المسافة بدقة بين خطي شبكتين بالبكسل. اقسم هذه القيمة على المسافة المعروفة (10 ميكرومتر) ، لتحديد معايرة البكسل إلى الميكرون. احسب التكبير (M) للنظام باستخدام الحجم المقاس للبكسل والحجم المعروف للبكسل باستخدام المعادلة (1).(1) 7. الحصول على المسح الحجمي ضع العينة.قم بتشغيل معاينة الكاميرا ، galvo ، مولد الوظائف ، مصدر الطاقة ، المسرح ، وليزر الإثارة. قم بتركيب العينة ، ثم انقر فوق زر FSK على مولد الوظائف لتعيين موجة مثلث. للعثور على العينة ، استخدم مولد الوظائف لتعيين ما يلي: سعة 400 مللي فولت من الذروة إلى الذروة (باستخدام زر Ampl.) ، و 0 إزاحة (باستخدام زر الإزاحة ) ، وتردد 200 ميجاهرتز. استخدم نافذة Micromanager لتعيين وقت التعرض 100 مللي ثانية. قم بالتمرير في z يدويا حتى يتم الوصول إلى مستوى العينة. قم بتحسين إعداد z بحيث تمر المنطقة المطلوبة للمسح الحجمي عبر الشاشة خلال دورة واحدة. حدد معلمات الفحص.تأكد من تعيين السعة من الذروة إلى الذروة بشكل صحيح عن طريق التحقق بصريا من أن المعاينة تبدو في نطاق التركيز البؤري طوال مدة الفحص. إذا تدهورت جودة الصورة في وقت أقرب من أحد طرفي المسح الضوئي من الطرف الآخر ، فقم بتحرير الإزاحة على مولد الوظائف لتحريك مركز المسح نحو المنطقة الأفضل. في برنامج Micromanager ، حدد وقت التعرض ، وانقر فوق Multi-D Acq. لفتح نافذة الاستحواذ متعدد الأبعاد. استخدم مربع العد لاختيار عدد الإطارات ، والذي سيعين إجمالي وقت الاستحواذ. سيتم تعيين الفاصل الزمني بين الإطارات (معدل الإطارات) حسب وقت التعرض ما لم يتم تحديد فاصل زمني أطول في مربع الفاصل الزمني. في مولد الوظائف ، اضبط التردد لإنشاء مسح كامل الحجم بمقدار نصف فترة وظيفة موجة المثلث (المسح الخطي في اتجاه واحد).ملاحظة: إذا كان معدل الإطارات وترددها منخفضين جدا، الحصول على عدد قليل جدا من الإطارات لإجراء مسح ضوئي لوحدة التخزين، وسيؤدي رقم الإطار المنخفض إلى إنشاء عناصر مرئية في مرحلة ما بعد المعالجة. كمرجع ، يتكون الشكل 13 من ~ 100 إطار في المسح ، ويتكون الشكل 14 من ~ 800. من المهم أيضا مراعاة العينة نفسها عند اختيار المعلمات. تأكد من ضبط وقت التعرض بحيث تكون العينة متحمسة بدرجة كافية ولكنها غير مشبعة. يمكن أيضا تعديل شدة ليزر الإثارة لتحقيق هذه الغاية. إذا كان المستخدم يحصل على سلسلة من عمليات المسح الحجمي لتوصيف عملية متغيرة زمنيا في 3D ، فتأكد من أن الجدول الزمني للمسح يتجاوز ديناميكيات النطاق الزمني للنظام. جمع مقاطع الفيديو: احصل على فاصل زمني يلتقط على الأقل مدة الصعود الكامل لأعلى أو لأسفل لموجة المثلث ، بما يتوافق مع مسح كامل واحد لوحدة التخزين. 8. إجراءات ما بعد المعالجة مكدسات الصور الحجمية المنحرفةقم بتحريف عمليات مسح وحدة التخزين لتحويل مجموعة الصور في المستويات المائلة إلى سلسلة من الصور في إحداثيات xyz الحقيقية.ملاحظة: يوجد العديد من الأدلة الممتازة حول المعالجة اللاحقة للصور ذات الأوراق الضوئية والبرامج مفتوحة المصدر لإجراء عمليات مسح الحجم الحالية ، وكذلك لإجراء عمليات الانحراف وحفظ الصور المنحرفة أثناء الاستحواذ24. لتحريف عمليات مسح وحدة التخزين ، احصل على المعلمتين التاليتين: المسافة الحقيقية بين إطارين بالبكسل (d) ، والزاوية بين مستوى الإطار ومستوى x-y (يتم تعيين θ بزاوية ورقة الضوء المائلة (في هذا النظام ، 30 درجة). تعتمد المسافة بين الإطارات على بصريات التصوير وإعدادات الاستحواذ. العثور على المعلمة dقم بمعايرة المسافة بين الإطارات في كل مرة يتم فيها إعادة محاذاة النظام بشكل كبير. قم بإجراء هذه المعايرة باستخدام مجموعة من صور حبات الفلورسنت ، لأنها أسهل استخدام لتشخيص المشكلات. احصل على كومة من الصور ، وقم بتشغيل التعليمات البرمجية المنحرفة باستخدام أي تخمين أولي للمعلمة d . افتح مكدس الصور المنحرف في ImageJ، وقم بالتمرير خلال المكدس. إذا تم تعيين d بعيدا بشكل كبير عن قيمته الحقيقية ، فلاحظ أن الخرزات ستظهر ممدودة بشكل مصطنع في x أو y ، وستظهر الخرزات الفردية تتحرك في المستوى xy أثناء تمرير المستخدم عبر الإطارات في z (بدلا من التركيز وإلغاء التركيز من نفس النقطة المركزية). كرر فوق المعلمة d عدة مرات حتى تصبح هذه المشكلات غير واضحة. بمجرد أن تبدو المعلمة d قريبة بشكل معقول من القيمة الحقيقية ، احسب إسقاطات الكثافة القصوى لمكدس الصور على طول الاتجاهين x و y. لاحظ أن الخرزات ذات القطر بالقرب من حد الحيود قد تظهر ممدودة في z ، لكن من الأفضل ألا تظهر مخروطية أو ممدودة قطريا. قم بضبط معلمات deskewing حتى لا تتحسن هذه المعايير بشكل كبير مع التكرارات الجديدة. كمرجع ، كانت البيانات الموضحة في الشكل 13 منحرفة عند d = 2.50 بكسل ، وكانت البيانات الواردة في الشكل 14 منحرفة عند d = 1.0 بكسل.ملاحظة: ستعتمد المسافة بين الإطارات خطيا على سعة المسح الضوئي والتردد ومعدل الإطارات.

Representative Results

أجرينا مسحا حجميا لخرز 1 ميكرومتر مضمن في صمغ جيلان. يوضح الشكل 14 الإسقاطات القصوى للكثافة للمسح الحجمي المنحرف على طول الاتجاهات x و y و z. الشكل 14: التصوير الحجمي لحبيبات الفلورسنت 1 ميكرومتر في صمغ جيلان. يتم عرض الإسقاطات القصوى لكثافة عمليات المسح الحجمي المنحرفة. قضبان المقياس = 30 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. لقد أثبتنا استخدام المجهر أحادي الهدف ذو الصفيحة الضوئية لتوصيف شبكات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها عن طريق إجراء مسح حجمي لعينات من زهور النجمة ذات الأنابيب الدقيقة. باختصار ، تم بلمرة الأنابيب الدقيقة المستقرة بالتاكسول الموسومة بالرودامين من الدايمرات المعاد تشكيلها بواسطة GTP. بعد البلمرة ، تم خلط مجموعات محركات كينيسين القائمة على الستربتافيدين في عينات جنبا إلى جنب مع ATP للتركيزات النهائية من 6 ميكرونبيبات ميكرومتر ، و 0.5 ميكرومتر من دايمرات كينيسين ، و 10 مللي متر ATP. يمكن العثور على بروتوكولات وأدلة شاملة لإعداد الأنابيب الدقيقة المستقرة بالتاكسول ومجموعات محركات كينيسين على مواقع Mitchson Lab و Dogic Lab25,26. تم سحب العينات برفق في شرائح مجهرية ، ومختومة ، وسمح لها بالجلوس لمدة 8 ساعات قبل التصوير للسماح للنشاط الحركي بالتوقف بحيث وصلت العينات إلى حالة هيكلية ثابتة تشبه زهور النجمة. غالبا ما تستخدم دراسات أنظمة الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها الفحص المجهري البؤري أو فوق الفلوري لتصوير خيوط موسومة. ومع ذلك ، فإن كل من هذه التقنيات محدودة في قدرتها على تصوير عينات 3D كثيفة27. في حين تم إحراز تقدم كبير في أبحاث المادة النشطة القائمة على الهيكل الخلوي في المختبر من خلال تقييد العينات لتكون شبه2D 28,29 ، فإن شبكات الهيكل الخلوي هي بطبيعتها ثلاثية الأبعاد ، والعديد من المساعي الحالية تكمن في فهم التأثيرات التي يمكن أن تنشأ فقط في عينات ثلاثية الأبعاد29,30 ، مما يخلق حاجة إلى تصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة. الشكل 15: تسهيل التصور ثلاثي الأبعاد لعينات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها بواسطة المجهر ذو الهدف الواحد. (أ) صور زهور النجمة الفلورية ذات الأنابيب الدقيقة التي تم الحصول عليها على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر Leica DMi8. تظهر الصور مستويات مختلفة من z-scan. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. (B) صور منحرفة غير ملتفة من مسح حجمي تم إجراؤه على إعداد ورقة ضوئية أحادية الهدف لنفس العينة. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. تتوافق منطقة الصورة المنحرفة هنا مع FoV القابل للاستخدام (الصندوق الأصفر) الموضح في الشكل 13B. بينما يتفوق البؤر في تصوير الطائرات الفردية بالقرب من غطاء الغطاء ، فإن كثافة عينة الفلورسنت تحدث مضاعفات عند التصوير في مستويات أعلى بسبب الإشارة الإضافية من أسفل مستوى التصوير. تتحايل ورقة الضوء على هذه المشكلة من خلال إضاءة مستوى التصوير فقط ، مما يسمح بالتصوير الحاد بشكل موحد في مستويات مختلفة في z. الاختصارات: SOLS = ورقة ضوء أحادية الهدف ؛ FoV = مجال الرؤية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. في الشكل 15 ، نوضح التصوير الحجمي لشبكة الأنابيب الدقيقة المعاد تشكيلها والتي تم تقليصها إلى هياكل تشبه النجمة بواسطة مجموعات محركات كينيسين. كما هو موضح في البحث السابق28,31 ، تميل هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد إلى النمو بكثافة نحو المركز ، مما يؤدي إلى مناطق مشرقة من التألق السائدة في الإشارة. في طائرات التصوير بالقرب من غطاء الغطاء (مستوى z منخفض) ، يمكن للفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 15A) حل خيوط مفردة حول محيط النجمة ، مع خلفية إضافية نحو المركز بسبب إشارات مضان خارج التركيز من الأعلى. ومع ذلك ، فإن تحريك بضعة ميكرونات في z يقلل بسرعة من جودة الصور بسبب الأجزاء الكثيفة خارج التركيز البؤري من النجم السائدة في الإشارة في مستوى التصوير. تعمل الإضاءة أحادية المستوى لورقة الضوء (الشكل 15B) على التخلص من الإشارات خارج التركيز من الأجزاء الكثيفة من النجمة أعلى وأسفل مستوى التصوير ، مما يسمح بجودة صورة قابلة للمقارنة بين المستويات. إن قدرة الورقة الضوئية على إنتاج بيانات مسح حجمي عالية الجودة وموثوقة تفتح إمكانية تصور وتوصيف ظواهر 3D في أنظمة الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها.

Discussion

هناك تفصيلان مهمان فيما يتعلق بهذا البروتوكول هما التكلفة الإجمالية للنظام ووقت البناء والمحاذاة المتوقع. على الرغم من أن التكلفة الدقيقة متغيرة ، يمكننا أن نقدر بشكل مريح أن التكلفة الكاملة ل SOLS أو نظام DIY مشابه ستقع في حدود 85,000 دولار أمريكي. نلاحظ أن هذا التقدير يأخذ في الاعتبار سعر التجزئة لجميع المكونات ، لذلك قد يتم تخفيض هذا السعر الإجمالي بشكل كبير من خلال تحديد مصادر المكونات المستخدمة. من حيث وقت الإنشاء ، سيكون من المعقول توقع قيام مستخدم لديه خبرة قليلة في البصريات ببناء ومحاذاة نظام SOLS بأكمله في غضون 1-2 أشهر ، بشرط أن تكون جميع المكونات متوفرة وجاهزة. على الرغم من طول البروتوكول وتعقيده ، نعتقد أن مقدار التفاصيل في المخطوطة المكتوبة ، مقترنا ببروتوكول الفيديو ، يجب أن يجعل هذا البروتوكول مباشرا وسريعا في المتابعة.

هناك خطوتان حاسمتان في هذا البروتوكول. أولا ، يحدد موضع galvo موضع العديد من العدسات لأنه جزء من ثلاثة أزواج عدسات 4f منفصلة. من الأهمية بمكان أن يتم اقتران galvo مع المستويات البؤرية الخلفية ل O1 و O2 وتوسيطها بشكل صحيح لضمان المسح الضوئي الثابت للإمالة. ثانيا ، جودة الصورة حساسة للغاية لمحاذاة O2 و O3 فيما يتعلق ببعضهما البعض. هنا ، يجب توخي الحذر للتأكد من أن زاوية المحاذاة من O3 إلى O2 تتطابق أولا مع إمالة ورقة ضوء الإثارة ، وبالتالي توفير إضاءة مسطحة إلى أقصى حد عبر FoV المائل بالمثل. ثانيا ، يجب وضع O3 على المسافة المحورية الصحيحة للحفاظ على FoV مسطح بأكبر مساحة ممكنة. ثالثا ، يجب وضع O3 على المسافة الجانبية الصحيحة من O2 لتعظيم الإشارة التي تمر عبر واجهة O2-O3.

من حيث FoV القابل للاستخدام ، حقق هذا النظام مجالا مسطحا وموثوقا به مع إضاءة متسقة عبر مساحة 80 ميكرومتر × 80 ميكرومتر. هذه المنطقة أصغر من الحد الأقصى ل FoV الذي توفره الكاميرا ، لذلك يشار إلى FoV القابل للاستخدام بواسطة المربع الأصفر في الشكل 13. من حيث قوة الحل ، حقق هذا النظام مسافة قابلة للحل لا تقل عن 432 نانومتر على طول المحور السيني و 421 نانومتر على طول المحور ص ، والتي تم قياسها من خلال إيجاد متوسط سيغما x و y لتناسب غاوسيان لدوال انتشار النقطة (PSFs) في FoV الجيد والضرب في اثنين. نلاحظ أن هذا النظام لم يتم تحسينه من حيث إجمالي NA ، مما يعني أن هناك مجالا للتحسين الكبير إذا رغب المستخدمون في قوة حل أعلى مما حققه هذا النظام. هناك العديد من الخيارات الموضوعية المتوافقة لهذا النوع من بناء SOLS ، والتي سيساهم الكثير منها في دقة نظام أعلى ولكن مع عيوب التكلفة الأعلى أو FoV الأصغر أو تقنيات المحاذاة الأكثر تعقيدا في واجهة الترحيل^{8،11،13،20}. بشكل منفصل ، إذا رغب المستخدمون في الحصول على FoV أكبر ، فإن دمج galvo ثان للسماح بمسح 2D سيحقق هذا الهدف ولكنه سيتطلب دمج بصريات وميكانيكا تحكم إضافية في التصميم³². لقد قدمنا مزيدا من التفاصيل حول التعديلات على النظام على صفحة موقعنا على الويب ، إلى جانب روابط لموارد مفيدة أخرى تتعلق بعملية التصميم²³.

بالإضافة إلى تحسين المكونات المحددة لهذا التصميم المعين ، سيكون من الممكن جدا إضافة تقنيات أو طرائق مجهرية أخرى عالية الدقة إلى هذا البناء. أحد هذه التحسينات هو دمج الإضاءة متعددة الأطوال الموجية ، والتي ستتضمن محاذاة ليزر إثارة إضافي إلى مسار الإثارة الأصلي⁸. علاوة على ذلك ، نظرا لأن هذا النوع من تصميم SOLS يترك العينة متاحة ، فإن إضافة وظائف إضافية إلى المجهر ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الملقط البصري ، وعلم الموائع الدقيقة ، وقياس الريومترية ، يكون واضحا نسبيا ^2,33.

مقارنة بأدلة ورقة الضوء التي لا تعد ولا تحصى التي تم نشرها ، يوفر هذا البروتوكول تعليمات على مستوى من الفهم قد يجدها المستخدم الذي ليس لديه خبرة كبيرة في البصريات مفيدا. من خلال إنشاء SOLS سهل الاستخدام باستخدام إمكانات تركيب شرائح العينات التقليدية في متناول جمهور أكبر ، نأمل في تمكين المزيد من التوسع في تطبيقات البحث القائم على SOLS في جميع المجالات التي تستخدم فيها الأداة أو يمكن استخدامها. حتى مع النمو السريع لتطبيقات أدوات SOLS في العدد^2،34،35 ، نعتقد أن العديد من الفوائد والاستخدامات للأدوات من نوع SOLS لا تزال غير مستكشفة ونعرب عن الإثارة في إمكانيات هذا النوع من الأدوات للمضي قدما.

Materials

1" Plano-Concave Lens f = -50 mm	Thorlabs	LC1715-A-ML	For alignment laser Estimated Cost: $49.5
1" Achromatic Doublet f = 100 mm (x3)	Thorlabs	AC254-100-A-ML	L2, L4 and alignment laser Estimated Cost: $342.42
1" Achromatic Doublet f = 125 mm	Thorlabs	AC254-125-A-ML	SL2 Estimated Cost: $114.14
1" Achromatic Doublet f = 150 mm	Thorlabs	AC254-150-A-ML	L3 Estimated Cost: $114.14
1" Achromatic Doublet f = 150 mm	Thorlabs	AC254-150-A-ML	TL2 Estimated Cost: $114.14
1" Achromatic Doublet f = 45 mm	Thorlabs	AC254-045-A-ML	L1 Estimated Cost: $114.14
1" Achromatic Doublet f = 75 mm	Thorlabs	AC254-075-A-ML	SL1 Estimated Cost: $114.14
1" Cylindrical Lens f = 100 mm	Thorlabs	LJ1567RM	CL3 Estimated Cost: $117.62
1" Cylindrical Lens f = 200 mm	Thorlabs	LJ1653RM	CL2 Estimated Cost: $111.22
1" Cylindrical Lens f = 50 mm	Thorlabs	LJ1695RM	CL1 Estimated Cost: $117.62
1" Mounted Pinhole, 30 µm Pinhole Diameter	Thorlabs	P30K	Estimated Cost: $77.08
1" Silver Mirror (x3)	Thorlabs	PF10-03-P01	M1, M2, one for alignment Estimated Cost: $168.78
2" Elliptical Mirror	Thorlabs	PFE20-P01	M3 Estimated Cost: $179.98
2" Post Holder (x11)	Thorlabs	PH2	For custom laser mount, ND wheel, safety screens Estimated Cost: $98.45
2" Posts (x47)	Thorlabs	TR2	For custom laser mount and optical components Estimated Cost: $277.3
3" Posts (x4)	Thorlabs	TR3	For M3 supports and other mounts Estimated Cost: $24.6
3" Post Holder (x4)	Thorlabs	PH3	Estimated Cost: $38.48
30 to 60 mm Cage Adapter	Thorlabs	LCP33	To mount O1 Estimated Cost: $45.42
30mm Cage Filter Wheel	Thorlabs	CFW6	To mount ND filters Estimated Cost: $172.36
30mm Cage Plate (x6)	Thorlabs	CP33	To build alignment cage and alignment laser Estimated Cost: $114.54
30mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount (x3)	Thorlabs	KCB1	To mount M1 and M2 and for alignment laser Estimated Cost: $463.95
4" Post Holder (x30)	Thorlabs	PH4	Estimated Cost: $320.1
561 nm Laser and Power Supply	Opto Engine LLC	MGL-FN-561-100mW	Excitation laser Estimated Cost: $6000
60mm Cage Plate (x2)	Thorlabs	LCP01	To mount TL1 and M3 mount Estimated Cost: $88.52
60mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount	Thorlabs	KCB2	To mount M3 Estimated Cost: $187.26
90° Flip Mount	Thorlabs	TRF90	For alignment laser Estimated Cost: $95.5
Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads	Thorlabs	SM1A9	To connect lens tube to camera Estimated Cost: $20.96
Adapter with External SM1 Threads and Internal C-Mount Threads	Thorlabs	SM1A10	To connect tube lens to lens mount Estimated Cost: $21.82
Adapter with External SM1 Threads and Internal M25 Threads (x2)	Thorlabs	SM1A12	To mount O1 and O2 Estimated Cost: $47.06
Adapter with External SM1 Threads and Internal M26 Threads	Thorlabs	SM1A27	To mount O3 Estimated Cost: $22.38
Alignment Disk	Thorlabs	SM1A7	Estimated Cost: $20.45
Alignment Laser	BISKEE		https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Estimated Cost: $16.98
Autoluorescent Plastic Slide, Red	Chroma	92001	Estimated Cost: $20
Beam Shutter	Thorlabs	SM1SH1	To block laser light Estimated Cost: $65.8
Cage Rotation Mount (x3)	Thorlabs	CRM1T	To mount CL1-3 Estimated Cost: $282.15
Cage System Rods 1" (x8)	Thorlabs	ER1	To mount M3 and O1 Estimated Cost: $44.8
Cage System Rods 3" (x2)	Thorlabs	ER3	To mount O3 Estimated Cost: $14.28
Cage System Rods 4" (x4)	Thorlabs	ER4	To mount slit Estimated Cost: $30.76
Cage System Rods 8" (x2)	Thorlabs	ER8	For tube lens alignment Estimated Cost: $25.3
Cage System Rods 12" (x8)	Thorlabs	ER12	For alignment cage Estimated Cost: $145.36
Camera	Andor	Zyla 4.2 sCMOS	Estimated Cost: ~$14,000
Clamping Fork (x35)	Thorlabs	CF125	To clamp down post mounts Estimated Cost: $338.8
Cover Glass, 22 x 22 mm	Corning	2850-22	For slide samples Estimated Cost: $265
Dichroic	AVR	DI01-R405/488/561/635-25×36	To split exciation/emission paths Estimated Cost: $965
Dovetail Translation Stage	Thorlabs	DT12	To translate pinhole Estimated Cost: $90.55
Emission Filter	Thorlabs	FELHO600	Estimated Cost: $140.99
Frosted Glass Alignment Disk (x2)	Thorlabs	DG10-1500-H1	For alignment cage and intermediate plane Estimated Cost: $75.14
Function Generator	Hewlett-Packard	HP 33120A 15 MHz	To control galvo Estimated Cost: $900
Galvanometer – 1D Large Beam Diameter System	Thorlabs	GVS011	Estimated Cost: $1715.78
Galvanometer Power Supply	Siglent	SPD3303C	Estimated Cost: $300
Gelrite	Research Products International	G35020-100.0	Gellan gum for 3D bead sample Estimated Cost: $68.25
FIJI Software	Open-source		Download from https://imagej.net/software/fiji/downloads Estimated Cost: Free
Hot Plate/ Stirrer	Corning	6795-220	For preparing sample solutions Estimated Cost: $550
K-Cube Brushed Motor Controller	Thorlabs	KDC101	Drives Z825B Estimated Cost: $757.51
Kinematic Mount	Thorlabs	KM100S	To mount dichroic Estimated Cost: $92.01
Kinesis Software	Thorlabs		Download from https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Estimated Cost: Free
Laser Light Blocker	Thorlabs	LB1	For ND filter reflections Estimated Cost: $57.65
Laser Mount	custom made		3D printed Estimated Cost: N/A
Laser Safety Screen (x2)	Thorlabs	TPS4	For blocking stray laser light Estimated Cost: $92.02
Laser Scanning Tube Lens	Thorlabs	TTL200MP	TL1 Estimated Cost: $1491
Lens Mount (x10)	Thorlabs	LMR1	To mount all lens and extra alignment mirror. Estimated Cost: $164.7
Magnetic Ruler	Thorlabs	BHM4	To check alignment Estimated Cost: $52.74
Micro-Manager Software	Open-source		Download from https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Estimated Cost: Free
Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	12550400	For slide samples Estimated Cost: $123.9
Microscope Stage	ASI	FTP-2000 with custom parts	To fine-translate samples Estimated Cost: ~$16,000
Mini Vortex Mixer	VWR	10153-688	For sample preparation Estimated Cost: $152.64
Motorized Actuator	Thorlabs	Z825B	To fine-translate M1 Estimated Cost: $729.07
Mounted Standard Iris (x2)	Thorlabs	ID20	At least 2 for alignment Estimated Cost: $118.02
ND Filter Set	Thorlabs	NDK01	To reduce excitation intensity Estimated Cost: $726.73
Objective Lens 1	Nikon	Plan Apo 60X/ 1.20 WI	O1 Estimated Cost: ~$15,000
Objective Lens 2	Nikon	TU Plan Fluor 100X/0.90	O2 Estimated Cost: ~$6,000
Objective Lens 3	Mitutoyo	Plan Apo HR 50X/0.75	O3 Estimated Cost: ~$6,800
OPM Deskewing Software	Open-source		For image processing. Download from https://github.com/QI2lab/OPM Estimated Cost: Free
Photodiode Power Sensor	Thorlabs	S121C	For measuring laser intensity Estimated Cost: $379.68
Positive Grid Distortion Target	Thorlabs	R1L3S3P	Brightfield alignment Estimated Cost: $267.87
Power Meter Digital Console	Thorlabs	PM100D	For measuring laser intensity Estimated Cost: $1245.48
Rhodamine 6G	Thermo Scientific	J62315.14	For fluorescent coated slide sample Estimated Cost: $27.7
Right-Angle Clamp for Posts	Thorlabs	RA90	For M3 support and flip down mirror Estimated Cost: $32.46
RMS-Threaded Cage Plate (x2)	Thorlabs	CP42	For alignment laser Estimated Cost: $70.56
Shear Plate 2.5-5.0 mm	Thorlabs	SI050P	Estimated Cost: $182.85
Shear Plate 5.0-10.0 mm	Thorlabs	SI100P	Estimated Cost: $201.47
Shear Plate 10.0-25.4 mm	Thorlabs	SI254P	Estimated Cost: $236.42
Shear Plate Viewing Screen	Thorlabs	SIVS	Estimated Cost: $337.74
Shearing Interferometer with 1-3 mm Plate	Thorlabs	SI035	For checking collimation Estimated Cost: $465.85
Slip-On Post Collar (x35)	Thorlabs	R2	To maintain post height Estimated Cost: $208.25
Slit	Thorlabs	VA100	Estimated Cost: $294.64
Slotted Lens Tube, 3"	Thorlabs	SM1L30C	For alignment laser Estimated Cost: $77.45
Square Mirror, 1 x 1"			https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069&hvpos=&hvne tw=g&hvrand=1336734911900437 4691&hvpone=&hvptwo=&hvqmt= &hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=& hvlocphy=9031212&hvtargid=pla-1 943952718742&gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB&th=1 Estimated Cost: $14.76
Stackable Lens Tube 1/2" (x3)	Thorlabs	SM1L05	To mount CL1-3 Estimated Cost: $40.86
Stackable Lens Tube 1"	Thorlabs	SM1L10	To mount O3 Estimated Cost: $15.41
Stackable Lens Tube 2" (x2)	Thorlabs	SM1L20	For camera path Estimated Cost: $35.7
Studded Pedestal Base Adapter (x37)	Thorlabs	BE1	To attach post mounts to table Estimated Cost: $400.71
Translating Lens Mount (x3)	Thorlabs	LM1XY	To fine-translate pinhole, O2 and O3 Estimated Cost: $441
Translation Stage with Standard Micrometer (x2)	Thorlabs	PT1/M	TS1-2 Estimated Cost: $647.54
Travel Manual Translation Stage	Thorlabs	CT1A	O3 cage translation mount Estimated Cost: $497.3
Tube Lens	Nikon	MXA20696	TL3 Estimated Cost: $359
White Mounted LED	Thorlabs	MNWHL4	Brightfield light source Estimated Cost: $171.28
			TOTAL ESTIMATED COST: $84,858.98
			The authors note that many parts were bought used. Here, we have attempted to reflect the retail price of all items, so the total cost can be greatly reduced by buying particular items used, especially the more expensive ones.
OPTIONAL COMPONENTS
Grasshopper3 USB3	FLIR	GS3-U3-23S6C-C	For diagnostic checks during alignment. Acquisiton camera can be used instead, but requires realignment afterwards. Estimated Cost: $1089