Design og opbygning af et tilpasseligt, enkeltobjektivt, lysarkfluorescensmikroskop til visualisering af cytoskeletnetværk

Summary

Denne protokol beskriver detaljeret, hvordan man opbygger et enkeltobjektivt, lysarkfluorescensmikroskop og dets anvendelse til visualisering af cytoskeletnetværk.

Abstract

Rekonstituerede cytoskeletkompositter er opstået som et værdifuldt modelsystem til undersøgelse af blødt stof uden ligevægt. Den trofaste indfangning af dynamikken i disse 3D, tætte netværk kræver optisk sektionering, som ofte er forbundet med fluorescenskonfokale mikroskoper. Den seneste udvikling inden for lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM) har imidlertid etableret det som et omkostningseffektivt og til tider overlegent alternativ. For at gøre LSFM tilgængelig for cytoskeletforskere, der er mindre fortrolige med optik, præsenterer vi en trinvis begyndervejledning til opbygning af et alsidigt lysarkfluorescensmikroskop fra hyldekomponenter. For at muliggøre prøvemontering med traditionelle diasprøver følger denne LSFM SOLS-designet (single-objective light-sheet), som bruger et enkelt mål til både excitations- og emissionsindsamling. Vi beskriver funktionen af hver komponent i SOLS tilstrækkeligt detaljeret til, at læserne kan ændre instrumenteringen og designe den, så den passer til deres specifikke behov. Endelig demonstrerer vi brugen af dette brugerdefinerede SOLS-instrument ved at visualisere asters i kinesindrevne mikrotubulusnetværk.

Introduction

Light-sheet fluorescens mikroskopi (LSFM) repræsenterer en familie af højopløselige fluorescensbilleddannelsesteknikker, hvor excitationslyset formes til et ark ^1,2, herunder selektiv planbelysningsmikroskopi (SPIM), fejet konfokalt justeret plan excitation (SCAPE) og skråplanmikroskopi (OPM) ^3,4,5,6,7. I modsætning til andre mikroskopimetoder såsom epifluorescens, total intern refleksionsfluorescensmikroskopi (TIRFM) eller konfokal mikroskopi er fototoksicitet minimal i LSFM, og prøver kan afbildes over længere tidsskalaer, fordi kun prøveplanet, der aktivt afbildes, belyses ^8,9,10. Derfor er LSFM-teknikker yderst nyttige til billeddannelse af 3D-prøver over længere tidsperioder, især selv dem, der er for tykke til konfokale mikroskopiteknikker. På grund af disse grunde er LSFM siden sin oprindelige udvikling i 2004 blevet den foretrukne billeddannelsesteknik for mange fysiologer, udviklingsbiologer og neurovidenskabsmænd til visualisering af hele organismer som levende zebrafisk og Drosophila-embryoner 3,4,6,11 . I de sidste to årtier er fordelene ved LSFM blevet udnyttet til at visualisere struktur og dynamik i gradvist mindre skalaer, herunder væv^11,12, cellulære og subcellulære skalaer, både in vivo og in vitro 13,14,15,17.

På trods af rapporterne om vellykkede brugssager i litteraturen forhindrer de høje omkostninger ved kommercielle LSFM-systemer (~ 0.25 millioner USD i skrivende stund)^18,19 den udbredte anvendelse af teknikken. For at gøre DIY-builds til et gennemførligt alternativ for forskere er der udgivet flere build-vejledninger 8,13,20,21, inklusive open-access-indsatsen OpenSPIM ²². Indtil videre kan forskere med minimal optikerfaring dog kun bruge tidligere LSFM-design, som er uforenelige med traditionelle diasmonterede prøver (figur 1A). Nylig implementering af enkeltobjektiv, lysark (SOLS) bruger et enkelt mål for både excitation og detektion (figur 1C) og overvinder derved begrænsningen relateret til kompatibilitet 5,6,8,13,20. Omkostningerne til alsidigheden af SOLS-designet er imidlertid en betydelig stigning i bygningens kompleksitet på grund af kravet om to yderligere mål om at videresende, de-vippe og genafbilde objektplanet på kameraet til billeddannelse (figur 1D). For at lette adgangen til de komplekse SOLS-stil opsætninger præsenterer dette papir trin-for-trin vejledning om design, opbygning, justeringsproces og brug af et diaskompatibelt SOLS-system, hvilket ville være nyttigt for forskere med viden om kun et entry-level optikkursus.

Selvom selve protokollen er kortfattet, skal læserne henvise til andre ressourcer under forberedelsestrinnene for at lære mere om bestemte dele af design- eller hardwareovervejelserne. Men hvis en læser har til hensigt at følge specifikationerne for dette design, er det muligvis ikke nødvendigt at forstå, hvordan man vælger bestemte optiske komponenter.

Figur 1: Karakteristika for forskellige LSFM-konfigurationer. (A) Opsætningen med to ortogonale mål, der var almindelige i tidlige LSFM-design. I denne konfiguration anvendes et kapillarrør eller en cylinder gel til at indeholde prøven, som ikke er kompatibel med traditionelle glidemonteringsteknikker. B) Et skema over et Sols-lysarkdesign, der viser følgende: C) det enkelte mål, der er anvendt til både excitations- og emissionsindsamling på prøveplanet (O1) dette gør det muligt at montere et traditionelt dias ovenpå og (D) relæobjektivsystemet i Sols-emissionsvejen. O2 indsamler emissionslyset og forstørrer billedet. O3 afbilder planet i den korrekte hældningsvinkel på kamerasensoren. Forkortelser: LSFM = lysarkfluorescensmikroskopi; SOLS = lysark med et enkelt objektiv O1-O3 = mål. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Forberedelse til justering Før du starter byggeriet, skal du udføre alle nødvendige litteraturgennemgange for at få en klar idé om den tilsigtede brugssag (f.eks. de fluoroforer, der skal afbildes, den nødvendige billedvolumen, opløsningskravene). Se især afsnittet om repræsentative resultater nedenfor for at afgøre, om det er hensigtsmæssigt at følge det nøjagtige design, der er beskrevet her. Hvis det er tilfældet, skal du gå videre til trin 1.2. Hvis ikke, kan du finde forslag og vejledning til valg af hardware på Sheunglab SOLS Build Guide23.BEMÆRK: Brugeren kan finde flere oplysninger om specifikationerne for dette særlige system i diskussionsafsnittet. Saml alle de nødvendige optiske, optomekaniske og elektriske komponenter som beskrevet i materialetabellen. For brugere, der ændrer systemet, skal du samle alle de tilsvarende dele. Byg justeringslaseren som vist i figur 2A. Kontroller, at strålen kolliderer ved hjælp af forskydningspladen. Byg det dobbelte frostede glasskivejusteringsbur som vist i figur 2B. Den fluorescerende farvestofbelagte prøve, klargøres.Opret en mættet rhodamin farvestofopløsning ved gradvist at tilsætte 1 ml destilleret vand til 0,2 g frysetørret pulver, indtil det hele er opløst. Vortex at homogenisere.BEMÆRK: Denne løsning er lysfølsom. Selvom der ikke er nogen nødvendige forholdsregler under tilberedningen, skal du sikre dig, at opløsningen opbevares i et mørkt område, efter at den er blevet tilberedt.FORSIGTIG: Brug altid handsker og en maske, når du håndterer rhodaminpulver. Pipette 10 μL på midten af et testobjektglas. Placer et 22 mm x 22 mm dækglas oven på væsken, og sørg for, at fluorescenslaget er så tyndt som muligt. Forsegl med klar neglelak.BEMÆRK: Denne prøve er lysfølsom. For at maksimere prøvens levetid skal du sørge for, at diaset opbevares i et mørkt område, når det ikke er i brug. Forbered 3D-perleprøven (1 μm perler indlejret i gel).Brug dobbeltklæbende tape til at oprette en 4-5 mm bred lodret kanal på et prøveglas tre lag tape højt. Placer et 22 mm x 22 mm dækglas oven på båndet i midten af diaset. Tryk hårdt på de tapede områder for at sikre en god tætning mellem tapen og dækglasset. Brug et barberblad til at fjerne overskydende tape. Forbered 125 ml mættet gellangummiopløsning ved gradvist at tilsætte DI-vand til 1 g gellangummipulver. Denne opløsning vil være fast ved stuetemperatur og flydende ved 65 °C. Der indføres 1 ml gellangummiopløsning i et mikrocentrifugerør. En beholder med vand opvarmes på en kogeplade ved 65 °C, og mikrocentrifugerøret opvarmes, indtil gellangummiet er synligt tyktflydende. Forbered 10 μL af en 1:1.000 fortynding af perler i opvarmet gellangummiopløsning. Opløsningen pipetteres forsigtigt ind i kammeret, indtil den er fuld. Brug et tandstikker til at duppe en lille mængde epoxy på begge sider af kanalen, der dækker åbningerne fuldt ud for at forsegle. For at sikre korrekt forsegling skal du visuelt inspicere begge ender for at sikre, at epoxy er trængt let ind i hver ende af kanalen. Figur 2: Billeder af justeringsværktøjerne. (A) Kollimeret justeringslaser. AL1: Justeringslinse 1, -50 mm; AL2: Justeringslinse 2, 100 mm (B) Dobbelt matteret glasskivejusteringsbur. Forkortelser: RMS CP = RMS gevindburplade; SM1 CP = SM1 gevind burplade. Klik her for at se en større version af denne figur. 2. Justering af excitationsstien Skitse mikroskoplayoutet på overfladen af det optiske bord. Mål alle afstande så præcist som muligt.BEMÆRK: Se figur 3 for placeringen af komponenterne i systemet. Monter excitationslaseren på bordet. Indstil to iris til laserens tilsigtede højde, og monter dem 2-3 fod fra hinanden på den ønskede linje af huller bag placeringen af spejl 1 (M1). Brug disse iris til at sikre, at strålen er i niveau med bordoverfladen og centreret på linjen af huller på det optiske bord.BEMÆRK: Brug lasersikkerhedsbriller til øjenbeskyttelse, og bloker eventuelle vildfarne laserstråler med lasersikkerhedsskærme som en sikkerhedsforanstaltning. Indtil alle komponenter er permanent fastspændt, er drift i størrelsesordenen timer mulig. Opsæt en iris på det fjerneste punkt af justeringen i slutningen af hver dag som en hurtig visuel kontrol for drift, når du vender tilbage til bygningen. Vibrationer, et forkert flydende optisk bord og luftstrømme er de mest almindelige årsager til optisk drift. Monter laserlukkeren så tæt som muligt på excitationslaseren. Brug denne lukker til hurtigt at blokere laserlyset under justering i stedet for gentagne gange at tænde og slukke for laseren. Saml ND-filtrene i ND-filterhjulet (ND 0,5, 1,0. 2,0, 3,0, 4,0 og en tom plads), og monter dem efter laserlukkeren. Skift den motoriserede aktuator til et oversættelsestrin (TS1), og indsæt derefter trinnet under placeringen af M1. Sørg for, at trinnet oversættes aksialt langs den samme linje af huller, som laserlyset følger. Indstil scenen midt i sit interval for den første placering.I de følgende trin 2.6-2.10 indsættes de reflekterende optiske komponenter i strålebanen en ad gangen for at rette laseren langs kurven som tegnet på bordet. Brug irisparret, der er indstillet til den nøjagtige højde, til at definere den ønskede udgangsstrålebane og styre placeringen og justeringen af hvert reflekterende element. For hvert element skal du justere højden og placeringen af holderen for at sikre, at den indgående stråle rammer midten. Drej derefter bunden af holderen for at rette bjælken langs den udtrukne strålebane på bordet, så den passerer gennem begge iris, og finjuster hældningen af den udgående stråle med knapperne på bagsiden af hvert beslag.BEMÆRK: Når hvert element er justeret til den korrekte højde, skal du tilføje en slip-on krave til stolpen for at sikre højden. Monter og juster M1 oven på TS1. Monter og juster dikroikum på bordet. Følg producentens anvisninger, tilslut galvo til strømforsyningen og funktionsgeneratoren. Monter galvoen således, at laseren er placeret på spejlets nøjagtige centrum. Tænd for galvoen, og tryk derefter på AM-knappen på bølgeformgeneratoren, og hold den nede for at indstille spejlhældningen til 0 V DC-strøm (midten af området). Juster nu galvoen til iriserne. Monter og juster spejl 2 (M2). Indsæt det store cylindriske spejl i det cylindriske spejlbeslag. Brug 1 i burstænger til at fastgøre en 30-60 mm buradapter over spejl 3 (M3). Brug knapperne på spejlbeslaget til at flade M3-spejlets hældning ud til den første placering. Monter det dobbeltfrostede glasjusteringsbur i buradapteren over M3; Sørg for at stramme sætskruerne på buradapteren, der holder justeringsburet på plads, hver gang det bruges til justering. Monter M3 på bordet, og juster højden og positionen, indtil bjælken er omtrent centreret på begge matterede glasjusteringsskiver. Klem M3 fast til bordet, og brug et stolpebeslag, 3 i stolpe, 90° klemme og 2 i stolpe på begge sider af M3 for at tilføje støtte ved hjælp af de tapede huller på hver side af spejlbeslaget. Brug knapperne på bagsiden af spejlet til at finjustere strålen.BEMÆRK: Alle reflekterende elementer i excitationsstien er nu indstillet og bør ikke berøres. Monter objektiv 1 (L1) på bordet. Til alle de indledende objektivplaceringer skal du bruge et fastskruet objektivmål til at centrere den indgående stråle på forsiden af objektivet. Juster hældningen og sideværts position af objektiv 1 (L1), indtil strålen er centreret på begge de matterede glasplader på justeringsburet over M3. Mount Lens 2 (L2) i sin respektive position for at skabe et 4f-system med L1. Flyt L2 aksialt for at opnå en kollimeret stråle, og brug excitationslaseren og forskydningspladen til at kontrollere kollimationen. Juster hældningen og sideværts position af L2 for at centrere strålen på begge de matterede glasskiver over M3. Monter pinhullet i et xy-oversættelsesbeslag. Monter dette oven på et 1D-oversættelsestrin for at give fin aksial oversættelse. Monter pinhole og stage på en stolpe og stolpemontering, og placer den på det fælles fokuspunkt mellem L1 og L2. Juster pinhole manuelt, indtil laserlyset kan ses gennem pinhole. Monter effektmålersensoren umiddelbart efter pinhullet, og brug bølgelængdeknappen på effektmålerens digitale konsol til at vælge excitationslaserens bølgelængde. Juster xy-positionen på pinhullet for at maksimere transmissionen og opnå en nær TEM00-stråleprofil. Juster derefter pinhullet aksialt med 1D-trinnet for yderligere at maksimere transmissionen. Monter objektiv 4 (L4) på bordet i dets position, og juster holderen til den korrekte højde. Juster L4 aksialt, så excitationsstrålen er fokuseret på galvoens overflade. Juster hældningen og sideværts position af L4 for at centrere strålen på begge de matterede glasskiver over M3. Monter objektiv 3 (L3) på bordet i dets position, og juster holderen til den korrekte højde. Brug excitationslaseren og forskydningspladen til at kontrollere kollimationen af L3 og L4. Juster hældningen og sideværts position af L3 for at centrere strålen på begge de matterede glasskiver over M3. Fjern L3 midlertidigt. Monter Scan-objektiv 1 (SL1) på bordet, og juster den aksiale afstand for at danne et kollimeret teleskop med L4, målt med forskydningspladen. Juster hældningen og sideværts position af SL1 for at centrere strålen på begge de matterede glasskiver over M3. Indsæt L3 igen. Monter rørlinse 1 (TL1), og brug excitationsstrålen og forskydningspladen til at kollidere SL1 og TL1. Juster hældningen og sideværts position af TL1 for at centrere strålen på begge de matterede glasskiver over M3. Skru mål 1 (O1) ind i burpladen over M3 ved hjælp af en adapterring. Fjern SL1 midlertidigt, og lad bjælken ramme loftet. Juster højden (aksial afstand) på O1 på bursystemet, indtil strålen danner en Airy-skive i loftet, og fortsæt derefter med at justere, indtil diskens størrelse minimeres. Når O1 er på plads, monteres prøvetrinnet i den rigtige position. Figur 3: Placering af komponenterne i Sols-systemet. (A) Sols-systemets skematiske layout med alle komponenter mærket. (B) Top-down foto af det fysiske SOLS-system på det optiske bord, eksklusive prøvestadiet. C) Top-down-foto af prøvefaseområdet (udvidelse til figur 3B). Excitationsstien er vist med grønt. Emissionsvejen vises med rødt. Objektivernes brændvidde: L1: 100 mm; L2: 45 mm; CL1: 50 mm; CL2: 200 mm; CL3: 100 mm; L3:150 mm; L4: 100 mm; SL1: 75 mm; TL1: 200 mm; SL2: 150 mm; TL2: 125 mm; TL3: 200 mm. Se materialefortegnelsen for mere detaljerede delspecifikationer. Forkortelser: SOLS = enkeltobjektiv lysark; ND hjul = filterhjul med variabel neutral densitet; L1-L4 = plano konkave achromat linser; CL1-CL3 = cylindriske linser; M1-M3 = spejle; TS1-TS2 = oversættelsesfaser; DM = dikroisk spejl; Galvo = scanning galvanometer; SL1-SL2 = scan linser; TL1-TL2 = rørlinser; O1-O3 = mål; EF = emissionsfilter. Klik her for at se en større version af denne figur. 3. Tilpasning af emissionsstien Indstil justeringslaseren.Monter to tomme burplader ved siden af excitationslaseren i samme højde som laseren. Brug disse burplader til at montere justeringslaseren ved at skubbe justeringslaserens burstænger ind i de tomme huller i de to burplader. Sørg for, at laseren kan indstilles til tændt position, enten ved at trykke rundt om tænd / sluk-knappen eller ved at tilslutte en tænd / sluk-knap. Fjern O1, og indsæt det matterede glasjusteringsbur igen. Brug et kinematisk spejlbeslag og et rullespejl til at justere justeringsstrålen til excitationsstrålebanen. Brug effektmåleren til at maksimere signalet fra justeringsstrålen efter pinhullet ved at finjustere de to spejle. Sørg for, at bjælken forbliver centreret på det matterede glasjusteringsbur. Fjern justeringsburet, og indsæt O1 igen. Placer det firkantede spejl på prøvetrinnet af O1, og juster spejlet aksialt, indtil stråleprofilens størrelse minimeres efter dikroisk. Monter en iris i emissionsvejen og langt nok tilbage, så Scan Lens 2 (SL2), Tube Lens 2 (TL2) og Objective 2 (O2) kan indsættes uden interferens. Juster denne iris til justeringslaseren. Monter en matteret glasskive mindst 1 ind bag iris, og sørg for, at denne også er justeret til laserlyset. Indsæt SL2 i den korrekte afstand målt fra galvo med en lineal. Juster hældningen og sideværts position af SL2, så den indgående justeringsstråle er centreret på SL2, og den udgående stråle passerer gennem iris- og frostet glasskiven. Indsæt TL2 i den korrekte afstand målt fra SL2 med en lineal. Juster hældningen og sideværts position af TL2, så den indgående justeringsstråle er centreret på TL2, og den udgående stråle passerer gennem iris- og frostglasskiven. Monter TS2 på bordet. Sørg for, at scenen oversættes langs O2’s optiske akse. Skru O2 på et xy-oversættelsesbeslag. Tilslut en stolpe under xy-beslaget for at montere O2 på oversættelsesfasen. Brug et skruemål til at centrere bagsiden af O2 på den røde laser. Juster xy-knapperne, og vip O2, så den røde justeringsstråle passerer gennem iris- og frostglasskiven. Flyt justeringslaseren til over O1 og rettet nedad i emissionsvejen. Tænd laseren, og sørg for, at denne stråle er centreret på alle linserne i emissionsvejen. Konjuger pupilplanerne for O1 og O2 ved at åbne iris og fjerne den matterede glasskive, så justeringsstrålen, der forlader O2, fortsætter uhindret til en fjern overflade eller væg (>0,5 m) (figur 4). Juster TS2, indtil strålen danner en lille Airy-disk på overfladen, og fortsæt derefter med at justere TS2 for at minimere størrelsen på Airy-disken.BEMÆRK: En stærkt divergerende stråle indikerer forkert placering af O2. Men fordi denne stråle passerer gennem to mål, er en lille mængde divergens iboende. Som sådan er Airy-disken den bedste guide. Optimer galvo til tilt-invariant scanning: Tryk på FSK-knappen på bølgeformgeneratoren for at vælge et trekantbølgesignal til galvoen, og indstil til en lav frekvens (~1 Hz). Overhold justeringsbjælken på den samme fjerne overflade eller væg.BEMÆRK: Hvis galvoen er placeret forkert, vil strålen feje vandret på overfladen sammen med galvobevægelsen. Dette kan løses ved finjustering (manuelt) af galvobasens hældning og xy-position, indtil stråleforskydningen ikke kan detekteres af øjet. Kontroller systemets kvalitet ved billeddannelse ved 0°.Skru O3 ind i et xy-oversættelsesbeslag. Skru et 1 tommer objektivrør ind i burets oversættelsestrin, og skru xy-oversættelsestrinnet ind i røret. Brug to burstænger til at forbinde forsiden af buroversættelsestrinnet til en burplade, og monter burpladen på en stolpe. Monter mål 3 (O3) tæt på forsiden af O2 (~4-5 mm) ved 0°, og juster højden, så den passer. Monter en matteret glasjusteringsskive i det delte brændplan mellem SL2 og TL2, målt med en lineal. Monter akrylfluorescerende testglas på scenen, og belys diaset med excitationslaseren. Se gennem bagsiden af O3, juster både højden og den aksiale position af O3 for at finde emissionslyset, og juster derefter O3 aksialt, indtil emissionslyset fylder bagblænden (figur 5). Skru to 8 i burstænger ind bag på O3-oversættelsestrinnet. Skub en burplade med en monteret matteret glasskive på stængerne, og finjuster derefter O3 ved hjælp af xy-beslaget for at sikre, at emissionslyset kommer ud af O3-centreret. Fjern derefter burstængerne. Monter en matteret glasskive i kamerasensorens ru position, og juster diskens højde og position i forhold til emissionslyset. Skru Tube Lens 3 (TL3) ind i en burplade, og monter den umiddelbart bag O3. Centrer TL3 på det indgående emissionslys, og juster derefter hældningen af TL3 for at justere det udgående lys i forhold til den matterede glasskive. Monter kameraet i den korrekte afstand fra rørobjektivet, målt med en lineal. Skru både 2 objektivrør og emissionsfilteret på kameraet. Monter den matterede glasjusteringsskive igen i det delte brændplan mellem SL2 og TL2. Monter testprøven for fluorescerende farvestof, og belys prøven med excitationsstrålen. Tænd kameraet, og åbn derefter Micromanager-programmet på den tilsluttede computer. Klik på Live for at åbne live view. Klik på Auto Once for at indstille de indledende eksponeringsindstillinger, og nulstil derefter eksponeringen efter behov ved billeddannelse.BEMÆRK: Micromanager fungerer ikke korrekt, medmindre den åbnes, efter at kameraet er tændt. Juster xy-oversættelsesknapperne på O3-holderen, indtil det lille hul i glasjusteringsskiven er centreret inden for synsfeltet (FoV). Juster O3 aksialt med buroversættelsestrinnet, indtil hullet er i fokus; kanterne skal se skarpe ud (figur 6). Billede fluorescerende perler for at kontrollere systemets kvalitet. Fjern den matterede glasjusteringsskive, monter 3D-perleprøven, og belys prøven med excitationsstrålen. Juster prøvens højde i forhold til O1, indtil de fluorescerende perler fylder et cirkulært område i midten af FoV. Finjuster positionen af O3 ved hjælp af xy-trinnet og det aksiale oversættelsestrin, indtil punktspredningsfunktionerne (PSF’er) er runde (indikerer minimale afvigelser) og lyse (indikerer et godt signal-støj-forhold) (figur 7). Hvis dette ikke kan opnås ved at justere O3, er det højst sandsynligt, at det optiske system mellem komponenterne O1 og O2 ikke er optimalt justeret; Følg diagnosticeringskontrollerne i trin 3.13 nedenfor. Hvis der kan opnås runde PSF’er , skal du springe diagnosetrinnet over og gå videre til at vippe billeddannelsessystemet. Udfør diagnostiske kontroller, hvis det er nødvendigt.BEMÆRK: Når der er opnået gode PSF’er, kan resten af diagnosticeringstrinnene springes over.Monter brightfield-lyset (BF) over O1. Monter det positive gittertestmål på prøvetrinnet i samme aksiale højde som justeringsspejlet. Centrer 10 μm gitteret, og belys gitteret med BF-lyset. Afbild gitteret på kameraet, og oversæt eksemplet, indtil gitteret er i fokus. Brug gitterbilledet til at bekræfte, at feltet på tværs af FoV er fladt: Hvis ikke, vises gitteret forvrænget og bøjet. For at korrigere for et dårligt gitterbillede skal du justere xyz-positionen og hældningen af O3 og derefter justere TL3 og kameraet i overensstemmelse hermed.BEMÆRK: Hvis der kan opnås et fladt gitter, skal du gentage trin 3.12.10 og derefter gå videre til at vippe billedbehandlingssystemet. Indstil justeringskameraet eller billedkameraet i den korrekte afstand, så SL2 fokuserer billedet på sensoren. Tag et billede af gittermålet på mellemplanet (figur 8). Hvis dette gitter også er skævt, er det meget sandsynligt, at det optiske system mellem komponenterne O1 og SL2 ikke er optimalt justeret og bør revideres. Optimer justeringen efter behov, før du fortsætter.BEMÆRK: Hvis kameraet ikke passer ind mellem SL2 og TL2, skal du bruge et ekstra spejl til at hoppe billedet 90° efter SL2 og på kameraet. PSF’erne kontrolleres på mellemplanet: Efter kontrol af gitteret er en anden god diagnostisk kontrol at kontrollere PSF’erne på samme mellemplan. Et godt billede på dette plan, som ligner figur 7 , men ved en anden forstørrelse (figur 9), indikerer god justering gennem SL2.BEMÆRK: Hvis der kan opnås et fladt gitter og runde PSF’er på mellemplanet, gentages trin 3.13.2, derefter trin 3.12.10 og derefter gå videre til hældning af billeddannelsessystemet. Vip O3-billedbehandlingsdelsystemet til 30°.Fjern O3, TL3 og kameraet. Genindsæt O3 ved 30° i O2’s optiske akse ved hjælp af linjerne på bordet som rettesnor. Monter en matteret glasjusteringsskive i det delte brændplan mellem SL2 og TL2. Monter akrylfluorescerende testglas på scenen, og belys diaset med excitationslaseren. Se igen gennem bagsiden af O3, juster både højden og den aksiale position af O3 for at finde emissionslyset ved 30 °, og juster derefter O3 aksialt, indtil emissionslyset fylder bagblænden. Fjern den matterede glasjusteringsskive mellem SL2 og TL2 for at opnå et stærkere emissionssignal. Skru to 8 i burstænger ind bag på O3-oversættelsestrinnet. Skub en burplade med en monteret matteret glasskive på stængerne, og finjuster derefter O3 ved hjælp af xy-beslaget for at sikre, at emissionslyset kommer ud af O3-centreret. Fjern derefter burstængerne. Monter en matteret glasskive i kamerasensorens ru position, og juster diskens højde og position i forhold til emissionslyset. Mount TL3 umiddelbart bag O3. Centrer TL3 på det indgående emissionslys, og juster derefter hældningen af TL3 for at justere det udgående lys i forhold til den matterede glasskive. For mere præcist at indstille TL3-kameraafstanden skal du forsigtigt skrue O3 af og montere justeringslaseren, så den fokuseres af TL3 på kameraet. Brug ND-filtre efter behov, så laserintensiteten er <1 mW. Start kameraets direkte visning, og juster TL3 aksialt for at minimere laserpunktet på kameraet. Monter den matterede glasjusteringsskive igen i det delte brændplan mellem SL2 og TL2. Monter testprøven for fluorescerende farvestof, og belys prøven med excitationsstrålen. Juster xy-oversættelsesknapperne på O3-beslaget, indtil det lille hul i glasjusteringsdisken er inden for FoV på kameraet. Juster buroversættelsestrinnet for at bevæge O3 aksialt, indtil hullet er i fokus; Sørg for, at hullet ser ud, som det gjorde ved 0°. Monter det positive gittertestmål igen i samme aksiale højde, og belys gitteret med BF-lyset. Bekræft, at kun én lodret sektion er i fokus (på grund af 30° hældning). Brug igen gitterbilledet til at bekræfte, at feltet på tværs af FoV er fladt, selv når det er ude af fokus. Når diaset oversættes aksialt, skal du bekræfte, at fokusdelen af FoV (gittermålet) fejer vandret hen over skærmen, mens gitterkvadraterne bevarer en ensartet størrelse (figur 10).BEMÆRK: På grund af billedplanets hældning ved prøven kan gitteret virke let strakt i x-planet. Figur 4: Laser-ind-laser-ud-teknik. Afsendelse af en kollimeret teststråle gennem fronten af O1 og observation af strålen, der forlader O2 på en fjern overflade. Hvis alle komponenterne er justeret i den korrekte afstand, vil strålen danne en lille Airy-skive på den fjerne overflade. Alle forkortelser er de samme som i figur 3. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 5: Brug af emissionslys til justering. (A) Emissionslys fra et akrylfluorescerende objektglas på et skruemål bag BFP af O2. (B) Find emissionslyset ved synet gennem bagsiden af O3. Forkortelser: O2-O3 = mål; BFP = bageste brændplan. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 6: Billede på kameraet af den korrekt fokuserede matterede glasjusteringsskive. Disken blev placeret på mellemplanet mellem SL2 og TL2. Skalabjælke = 50 μm. Forkortelser: SL2 = scan linse; TL2 = rørlinse. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 7: Kamerabillede af 3D-perleprøven. Billedet viser 1 nm perler med billedmodulet indstillet til 0° og oplyst af en cirkulær stråle, før de cylindriske linser indsættes. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 8: Positivt gittertestmål korrekt fokuseret på mellemplanet mellem SL2 og TL2. De flade gitre i hele feltet indikerer god justering af komponenterne SL2 og tidligere. Skalabjælke = 30 μm. Forkortelser: SL2 = scan linse; TL2 = rørlinse. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 9: Kamerabillede af 3D-perleprøven. Billedet viser 1 nm perler korrekt fokuseret på mellemplanet mellem SL2 og TL2. Skalabjælke = 30 μm. Forkortelser: SL2 = scan linse; TL2 = rørlinse. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 10: Positivt gittertestmål med en gul firkant af ensartet størrelse overlejret, så den matcher gitterets kvadrater. (A) Gitter i fokus på venstre side. (B) Gitter i fokus på højre side. Den gule firkant matcher størrelsen på gitterkasserne på begge sider af FoV. Skalastænger = 30 μm. Forkortelse = FoV = synsfelt. Klik her for at se en større version af denne figur. 4. Justering af det skrå lysark Fjern O1, og indsæt det dobbeltfrostede glasjusteringsbur igen på plads. Bekræft, at strålen er kollimeret og centreret på begge frostede glasskiver. Skru Cylindrisk linse 1 (CL1) ind i et roterende objektivbeslag. Monter CL1 i den optiske bane, og drej holderen, så strålen udvides i lodret retning til det optiske bord. Juster hældningen og sideværts position af CL1, så strålen er centreret på forsiden og opretholder en centreret position på begge frostede glasskiver. Skru Cylindrisk linse 2 (CL2) ind i et roterende objektivbeslag, og monter CL2 i den optiske bane i den korrekte afstand for at danne et 4f-system med CL1. Drej CL2 til samme retning som CL1, så strålen strækkes lodret i retning til det optiske bord og kollideres. Brug et testkort til at måle højden af den cylindriske stråleprofil flere steder for at sikre, at strålen kolliderer. Juster hældningen og sideværts position af CL2 som udført i trin 4.2. Skru Cylindrisk linse 3 (CL3) ind i et roterende objektivbeslag, og monter CL3 i den optiske bane i den korrekte afstand for at danne et 4f-system med L3. Drej CL3 til samme retning som både CL1 og CL2, så strålen fokuseres ned til en vandret arkprofil på brændplanet. Juster hældningen og sideværts position af CL3 som udført i trin 4.2. Indsæt slidsen: Brug fire 4 i burstænger og CL3-holderen til at montere slidsen lodret i brændplanet mellem CL3 og L3, målt med en lineal. Brug den strakte excitationsstråleprofil til at justere slidsens højde og laterale position, indtil den er centreret på strålen. Indsæt O1 igen, monter testprøven for fluorescerende farvestof, og belys prøven med excitationslysarket. Ved kamerasensoren skal du kontrollere, at 0°-lysarket vises som et tyndt lodret ark (figur 11A). Fjern testprøven for fluorescerende farvestof, og tør O1 ren. Lad lyspladen udvide sig over O1 uhindret. Brug den motoriserede oversættelsestrinkontrol til at oversætte M1 mod de cylindriske linser for at indstille lyspladens vinkel til ca. 60° i forhold til O1’s optiske akse.BEMÆRK: Det er afgørende, at lyspladen vippes i den rigtige retning for at flugte med det tilsvarende vippede billedplan (figur 12); Hvis et system er lagt anderledes ud end dette specifikke design, kan den korrekte hældningsretning beregnes gennem geometrisk strålesporing.BEMÆRK: Til reference ved oversættelse af M1 2.647 mm mod slidsen indstilles lyspladen til den korrekte hældning i denne opsætning. Indsæt testprøven for fluorescerende farvestof igen for at afbilde det vippede ark. Sørg for, at lyspladen har bevaret en lodret stråleform på kameraet, men er bredere og svagere (figur 11B) . Oversæt prøven aksialt med scenen, så det fluorescerende farvestof belyses af lyspladen i fem forskellige dybder mellem midten af FoV og højre side af skærmen. Gem hvert billede. Åbn billederne i Fiji. Vælg stregværktøjet for hvert billede, og tegn en vandret linje fra midten af FoV til midten af lysarket. Hvis du vil måle forskydningen, skal du gå til Analysér | Mål for at se længden af linjerne. Derefter plottes forskydningen af lyspladen som en funktion af prøvedybden for at beregne lyspladens vinkel over O1. Oversæt M1 lidt. Gentag trin 4.9 og trin 4.10, indtil lyspladens vinkel er 60° fra O1’s optiske akse, hvilket svarer til billedplanets vinkel. Figur 11: Kamerabilleder af prøven af fluorescerende farvestof oplyst af et korrekt formet lysark. (A) Arket ved 90°, lige op langs O1’s optiske akse, og (B) vippet til 30° (60° til O1’s optiske akse). Skalastænger = 50 μm. Forkortelse: O1 = mål. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 12: Korrekt retning af lysarkets hældning, så den flugter med billedplanet for O1. Forkortelse: O1-O3 = mål. Klik her for at se en større version af denne figur. 5. Finjustering af systemet til billedbehandling og dataindsamling Monter 3D-perlediaset, og oversæt prøven aksialt med scenen, indtil perlerne fylder FoV på kameraet. Juster O3 ved hjælp af xy-trinnet og buroversættelsestrinnet med det formål at minimere afvigelser og optimere signal-støj-forholdet i billedet (figur 13). Juster korrektionskraven på O1 med det formål at minimere afvigelser og optimere signal-støj-forholdet i billedet. Figur 13: Kamerabilleder af 3D-perleprøven (1 μm perler) oplyst af et korrekt formet lysark. (A) Ark ved 90°, lige op langs O1’s optiske akse, og (B) vippet til 30° i forhold til O1’s optiske akse. Den gule boks angiver den del af FoV, der er flad, konsistent og brugbar (80 μm x 80 μm), og hvor pålidelige data kan indsamles. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: O1 = mål; FoV = synsfelt. Klik her for at se en større version af denne figur. 6. Kalibrering af systemets forstørrelse Monter det positive gittertestmål på prøvetrinnet, og lys med lysstyrkelyset. Oversæt gittersliden aksialt med scenen for at bringe gittersliden i fokus. Sæt fokus på midten af gitteret. Tag og gem billedet, og åbn det derefter i Fiji. Brug linjeværktøjet og målefunktionen i Fiji til nøjagtigt at måle afstanden mellem to gitterlinjer i pixel. Divider denne værdi med den kendte afstand (10 μm) for at bestemme pixel-til-mikron-kalibreringen. Beregn systemets forstørrelse (M) ved hjælp af den målte pixelstørrelse og den kendte størrelse af en pixel med ligning (1).(1) 7. Erhvervelse af volumetriske scanninger Placer prøven.Tænd kameraets forhåndsvisning, galvo, funktionsgenerator, strømforsyning, scene og excitationslaser. Monter prøven, og klik derefter på knappen FSK på funktionsgeneratoren for at indstille en trekantbølge. For at finde prøven skal du bruge funktionsgeneratoren til at indstille følgende: 400 mV peak-to-peak-amplitude (ved hjælp af ampl. -knappen), 0 offset (ved hjælp af offset-knappen ) og 200 mHz frekvens. Brug Micromanager-vinduet til at indstille en eksponeringstid på 100 ms. Rul manuelt i z, indtil prøveplanet er nået. Optimer z-indstillingen , så det ønskede område til den volumetriske scanning passerer gennem skærmen i løbet af en cyklus. Vælg scanningsparametrene.Sørg for, at peak-to-peak-amplituden er indstillet korrekt ved visuelt at kontrollere, at forhåndsvisningen ser ud til at være i fokus under scanningen. Hvis billedkvaliteten forringes hurtigere og nærmer sig den ene ende af scanningen end den anden, skal du redigere forskydningen på funktionsgeneratoren for at flytte midten af scanningen mod det bedre område. I Micromanager-programmet skal du vælge en eksponeringstid og klikke på Multi-D Acq. for at åbne vinduet Multi-Dimensional Acquisition. Brug feltet Antal til at vælge antallet af billeder, som angiver den samlede anskaffelsestid. Intervallet mellem billeder (billedhastighed) indstilles af eksponeringstiden, medmindre der er angivet et længere interval i feltet Interval. På funktionsgeneratoren skal du indstille frekvensen for at oprette en fuld volumenscanning med halvdelen af perioden for trekantbølgefunktionen (lineær scanning i en retning).BEMÆRK: Hvis billedhastigheden og frekvensen er for lav, hentes der for få billeder til en volumenscanning, og det lave billednummer skaber synlige artefakter i efterbehandlingen. Som reference var figur 13 sammensat af ~100 billeder i scanningen, og figur 14 blev sammensat af ~800. Det er også vigtigt at overveje selve prøven, når parametrene vælges. Sørg for, at eksponeringstiden er indstillet, så prøven er tilstrækkeligt ophidset, men ikke mættet. Excitationslaserintensiteten kan også justeres til dette formål. Hvis brugeren erhverver en række volumetriske scanninger for at karakterisere en tidsvarierende proces i 3D, skal du sikre dig, at scanningstidsskalaen overstiger systemets tidsskaladynamik. Indsamling af videoer: Få en time-lapse, der mindst fanger varigheden af en fuld rampe op eller ned af trekantbølgen, svarende til en fuld scanning af lydstyrken. 8. Procedurer for efterbehandling Skævvridning af volumetriske billedstakkeDeskew volumenscanningerne for at konvertere stakken af billeder i skrå planer til en række billeder i rigtige xyz-koordinater.BEMÆRK: Der findes mange fremragende vejledninger om efterbehandling af lysarkbilleder og open source-software til at udføre skævvridning af eksisterende volumenscanninger samt til at udføre deskewing og gemme deskewed billeder under erhvervelse24. For at skriveborde volumenscanningerne skal du opnå følgende to parametre: den reelle afstand mellem to billeder i pixels (d) og vinklen mellem rammeplanet og x-y-planet (θ indstilles af vinklen på det skrå lysark (i dette system 30°). Afstanden mellem rammer afhænger af billedoptikken og anskaffelsesindstillingerne. Find d-parameterenKalibrer afstanden mellem rammerne, hver gang systemet justeres væsentligt. Udfør denne kalibrering med en stak billeder af fluorescerende perler, da disse er de nemmeste at bruge til diagnosticering af problemer. Anskaf en stak billeder, og kør deskewing-koden ved hjælp af et hvilket som helst indledende gæt for parameteren d . Åbn den skrivebordsyede billedstak i ImageJ, og rul gennem stakken. Hvis d er sat væsentligt langt fra sin sande værdi, skal du observere, at perlerne vises kunstigt aflange i x eller y, og individuelle perler ser ud til at bevæge sig i xy-planet, når brugeren ruller gennem rammerne i z (snarere end at fokusere og defokusere fra det samme centrale punkt). Gentag parameteren d flere gange, indtil disse problemer ikke længere er tydelige. Når parameteren d ser ud til at være rimelig tæt på den sande værdi, skal du beregne maksimale intensitetsprojektioner af billedstakken langs x- og y-retningerne. Bemærk, at perler med en diameter nær diffraktionsgrænsen kan virke aflange i z, men de bør ideelt set ikke fremstå koniske eller aflange diagonalt. Finjuster deskewing-parametrene, indtil disse kriterier ikke forbedres væsentligt med nye iterationer. Som reference blev dataene vist i figur 13 deskewed ved d = 2,50 pixels, og dataene i figur 14 blev deskewed ved d = 1,0 pixels.BEMÆRK: Afstanden mellem billeder afhænger lineært af scanningsamplitude, frekvens og billedhastighed.

Representative Results

Vi udførte volumetriske scanninger af 1 μm perler indlejret i gellangummi. Figur 14 viser de maksimale intensitetsfremskrivninger af de skrivebordede volumetriske scanninger langs x-, y- og z-retningerne. Figur 14: Volumetrisk billeddannelse af 1 μm fluorescerende perler i gellangummi. Fremskrivninger af maksimal intensitet af volumetriske scanninger på skrivebordet vises. Skalastænger = 30 μm. Klik her for at se en større version af denne figur. Vi har demonstreret brugen af det enkeltobjektive, lysarkmikroskop til at karakterisere rekonstituerede cytoskeletnetværk ved at udføre volumetriske scanninger af prøver af mikrotubulusaster. Kort sagt blev rhodaminmærkede, taxolstabiliserede mikrotubuli polymeriseret fra rekonstituerede dimerer ved GTP; derefter, efter polymerisation, blev streptavidinbaserede kinesinmotorklynger blandet i prøver sammen med ATP for endelige koncentrationer af 6 μM mikrotubuli, 0,5 μM kinesindimerer og 10 mM ATP. Omfattende protokoller og vejledninger til fremstilling af taxolstabiliserede mikrotubuli og kinesinmotorklynger findes på Mitchson Lab- og Dogic Lab-webstederne25,26. Prøverne blev pipetteret forsigtigt ind i mikroskopglas, forseglet og fik lov til at sidde i 8 timer før billeddannelse for at tillade motoraktivitet at ophøre, så prøverne nåede en stabil strukturel tilstand, der lignede asters. Undersøgelser af rekonstituerede cytoskeletsystemer anvender oftest konfokal eller epifluorescensmikroskopi til billedmærkede filamenter. Begge disse teknikker er imidlertid begrænsede i deres evne til at afbilde tætte 3D-prøver27. Mens der er gjort store fremskridt inden for in vitro cytoskeletbaseret aktiv stofforskning ved at begrænse prøver til at være quasi2D 28,29, er cytoskeletnetværk iboende 3D, og mange nuværende bestræbelser ligger i at forstå de virkninger, der kun kan opstå i 3D-prøver29,30, hvilket skaber et behov for 3D-billeddannelse i høj opløsning. Figur 15: Facilitering af 3D-visualisering af rekonstituerede cytoskeletprøver ved enkeltobjektiv lysarkmikroskopi. (A) Billeder af fluorescerende mikrotubulusasters erhvervet på et Leica DMi8 laserscanningskonfokalmikroskop. Billederne viser forskellige planer fra en z-scanning. Skalabjælke = 30 μm. (B) Deconvolved deskewed billeder fra en volumetrisk scanning udført på enkeltobjektiv lysarkopsætning af den samme prøve. Skalabjælke = 30 μm. Det skrivebordsbeklædte billedområde svarer her til den anvendelige FoV (gul boks) vist i figur 13B. Mens den konfokale udmærker sig ved billeddannelse af enkeltplaner nær dæksedlen, introducerer densiteten af den fluorescerende prøve komplikationer ved billeddannelse på højere planer på grund af det ekstra signal nedenunder billedplanet. Lysarket omgår dette problem ved kun at belyse billedplanet, hvilket giver mulighed for ensartet skarp billeddannelse på forskellige planer i z. Forkortelser: SOLS = enkeltobjektiv lysark; FoV = synsfelt. Klik her for at se en større version af denne figur. I figur 15 demonstrerer vi den volumetriske billeddannelse af et rekonstitueret mikrotubulusnetværk, der er kontraheret i asterlignende strukturer af kinesinmotorklynger. Som vist i tidligere forskning 28,31 har disse 3D-strukturer tendens til at vokse tæt mod midten, hvilket resulterer i lyse områder af fluorescens, der er fremherskende i signalet. I billedplaner nær dæksedlen (lavt z-niveau) kan konfokalmikroskopi (figur 15A) løse enkelte filamenter omkring asterens periferi med yderligere baggrund mod midten på grund af fluorescenssignaler uden for fokus ovenfra. Men at flytte et par mikrometer i z reducerer hurtigt kvaliteten af billederne på grund af de tætte sektioner af asteren, der er ude af fokus, er fremherskende i signalet i billedplanet. Lysarkets enkeltplanbelysning (figur 15B) eliminerer signalerne ude af fokus fra de tætte dele af asteren over og under billedplanet, hvilket giver mulighed for sammenlignelig billedkvalitet mellem planerne. Lysarkets evne til at producere pålidelige volumetriske scanningsdata af høj kvalitet åbner mulighed for at visualisere og karakterisere 3D-fænomener i rekonstituerede cytoskeletsystemer.

Discussion

To vigtige detaljer vedrørende denne protokol er de samlede omkostninger ved systemet og den forventede bygge- og justeringstid. Selvom de nøjagtige omkostninger er variable, kan vi komfortabelt estimere, at in toto-omkostningerne ved denne SOLS eller et lignende DIY-system ville falde i intervallet $ 85,000 USD. Vi bemærker, at dette skøn tager højde for detailprisen på alle komponenterne, så denne samlede pris kan reduceres betydeligt ved at købe brugte komponenter. Med hensyn til byggetiden ville det være rimeligt at forvente, at en bruger med ringe optikerfaring bygger og justerer hele dette SOLS-system inden for 1-2 måneder, forudsat at alle komponenterne er tilgængelige og klar. På trods af protokollens længde og kompleksitet mener vi, at mængden af detaljer i det skriftlige manuskript, parret med videoprotokollen, bør gøre denne protokol ligetil og hurtig at følge.

Der er to kritiske trin i denne protokol. For det første bestemmer placeringen af galvo placeringen af mange linser, da den er en del af tre separate 4f-objektivpar. Det er afgørende, at galvoen både er konjugeret med de bagerste brændplaner i O1 og O2 og centreret korrekt for at sikre tilt-invariant scanning. For det andet er billedkvaliteten ekstremt følsom over for justeringen af O2 og O3 i forhold til hinanden. Her skal man sørge for, at justeringsvinklen på O3 til O2 først matcher hældningen på excitationslysarket, hvilket giver maksimal flad belysning over den tilsvarende vippede FoV. For det andet skal O3 placeres i den korrekte aksiale afstand for at opretholde en flad FoV med så stort et areal som muligt. For det tredje skal O3 placeres i den korrekte laterale afstand fra O2 for at maksimere signalet, der passerer gennem O2-O3-grænsefladen.

Med hensyn til den anvendelige FoV opnåede dette system et fladt, pålideligt felt med ensartet belysning over et område på 80 μm x 80 μm. Dette område er mindre end den maksimale FoV, der leveres af kameraet, så den anvendelige FoV er angivet med den gule boks i figur 13. Med hensyn til opløsningskraften opnåede dette system en mindste opløselig afstand på 432 nm langs x-aksen og 421 nm langs y-aksen, som blev målt ved at finde den gennemsnitlige sigma x og y af Gaussiske passer til punktspredningsfunktioner (PSF’er) i den gode FoV og gange med to. Vi bemærker, at dette system ikke blev optimeret med hensyn til dets samlede NA, hvilket betyder, at der er plads til betydelige forbedringer, hvis brugerne ønsker en opløsningskraft, der er højere end hvad dette system opnåede. Der er et væld af kompatible objektive muligheder for denne type SOLS-build, hvoraf mange ville bidrage til en højere systemopløsning, men med ulemperne ved en højere pris, en mindre FoV eller mere komplicerede justeringsteknikker ved relægrænsefladen 8,11,13,20. Separat, hvis brugerne ønsker en større FoV, ville inkorporering af en anden galvo for at muliggøre 2D-scanning nå dette mål, men ville kræve, at yderligere optik og kontrolmekanik integreres i designet³². Vi har givet flere detaljer om ændringer af systemet på vores webside sammen med links til andre nyttige ressourcer vedrørende designprocessen²³.

Ud over at forbedre de specifikke komponenter til dette særlige design, ville det være meget muligt at tilføje andre mikroskopiteknikker eller modaliteter med høj opløsning til denne bygning. En sådan forbedring ville være at inkorporere multibølgelængdebelysning, hvilket ville indebære justering af yderligere excitationslasere til den oprindelige excitationsvej⁸. Desuden, fordi denne type SOLS-design efterlader prøven tilgængelig, er tilføjelse af yderligere funktioner til mikroskopet, herunder men begrænset til optisk pincet, mikrofluidik og reometri, relativt ligetil ^2,33.

Sammenlignet med de utallige lysarkguider, der er blevet offentliggjort, giver denne protokol instruktioner på et forståelsesniveau, som en bruger uden væsentlig optikerfaring kan finde nyttige. Ved at lave en brugervenlig SOLS-konstruktion med traditionelle prøvediasmonteringsfunktioner, der er tilgængelige for et større publikum, håber vi at muliggøre en endnu større udvidelse af anvendelserne af SOLS-baseret forskning på alle områder, hvor instrumentet har eller kan bruges. Selv med anvendelserne af SOLS-instrumenter, der hurtigt vokser i antal ^2,34,35, mener vi, at mange fordele og anvendelser af SOLS-type instrumenter stadig forbliver uudforskede og udtrykker begejstring over mulighederne for denne type instrument fremadrettet.

Materials

1" Plano-Concave Lens f = -50 mm	Thorlabs	LC1715-A-ML	For alignment laser Estimated Cost: $49.5
1" Achromatic Doublet f = 100 mm (x3)	Thorlabs	AC254-100-A-ML	L2, L4 and alignment laser Estimated Cost: $342.42
1" Achromatic Doublet f = 125 mm	Thorlabs	AC254-125-A-ML	SL2 Estimated Cost: $114.14
1" Achromatic Doublet f = 150 mm	Thorlabs	AC254-150-A-ML	L3 Estimated Cost: $114.14
1" Achromatic Doublet f = 150 mm	Thorlabs	AC254-150-A-ML	TL2 Estimated Cost: $114.14
1" Achromatic Doublet f = 45 mm	Thorlabs	AC254-045-A-ML	L1 Estimated Cost: $114.14
1" Achromatic Doublet f = 75 mm	Thorlabs	AC254-075-A-ML	SL1 Estimated Cost: $114.14
1" Cylindrical Lens f = 100 mm	Thorlabs	LJ1567RM	CL3 Estimated Cost: $117.62
1" Cylindrical Lens f = 200 mm	Thorlabs	LJ1653RM	CL2 Estimated Cost: $111.22
1" Cylindrical Lens f = 50 mm	Thorlabs	LJ1695RM	CL1 Estimated Cost: $117.62
1" Mounted Pinhole, 30 µm Pinhole Diameter	Thorlabs	P30K	Estimated Cost: $77.08
1" Silver Mirror (x3)	Thorlabs	PF10-03-P01	M1, M2, one for alignment Estimated Cost: $168.78
2" Elliptical Mirror	Thorlabs	PFE20-P01	M3 Estimated Cost: $179.98
2" Post Holder (x11)	Thorlabs	PH2	For custom laser mount, ND wheel, safety screens Estimated Cost: $98.45
2" Posts (x47)	Thorlabs	TR2	For custom laser mount and optical components Estimated Cost: $277.3
3" Posts (x4)	Thorlabs	TR3	For M3 supports and other mounts Estimated Cost: $24.6
3" Post Holder (x4)	Thorlabs	PH3	Estimated Cost: $38.48
30 to 60 mm Cage Adapter	Thorlabs	LCP33	To mount O1 Estimated Cost: $45.42
30mm Cage Filter Wheel	Thorlabs	CFW6	To mount ND filters Estimated Cost: $172.36
30mm Cage Plate (x6)	Thorlabs	CP33	To build alignment cage and alignment laser Estimated Cost: $114.54
30mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount (x3)	Thorlabs	KCB1	To mount M1 and M2 and for alignment laser Estimated Cost: $463.95
4" Post Holder (x30)	Thorlabs	PH4	Estimated Cost: $320.1
561 nm Laser and Power Supply	Opto Engine LLC	MGL-FN-561-100mW	Excitation laser Estimated Cost: $6000
60mm Cage Plate (x2)	Thorlabs	LCP01	To mount TL1 and M3 mount Estimated Cost: $88.52
60mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount	Thorlabs	KCB2	To mount M3 Estimated Cost: $187.26
90° Flip Mount	Thorlabs	TRF90	For alignment laser Estimated Cost: $95.5
Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads	Thorlabs	SM1A9	To connect lens tube to camera Estimated Cost: $20.96
Adapter with External SM1 Threads and Internal C-Mount Threads	Thorlabs	SM1A10	To connect tube lens to lens mount Estimated Cost: $21.82
Adapter with External SM1 Threads and Internal M25 Threads (x2)	Thorlabs	SM1A12	To mount O1 and O2 Estimated Cost: $47.06
Adapter with External SM1 Threads and Internal M26 Threads	Thorlabs	SM1A27	To mount O3 Estimated Cost: $22.38
Alignment Disk	Thorlabs	SM1A7	Estimated Cost: $20.45
Alignment Laser	BISKEE		https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Estimated Cost: $16.98
Autoluorescent Plastic Slide, Red	Chroma	92001	Estimated Cost: $20
Beam Shutter	Thorlabs	SM1SH1	To block laser light Estimated Cost: $65.8
Cage Rotation Mount (x3)	Thorlabs	CRM1T	To mount CL1-3 Estimated Cost: $282.15
Cage System Rods 1" (x8)	Thorlabs	ER1	To mount M3 and O1 Estimated Cost: $44.8
Cage System Rods 3" (x2)	Thorlabs	ER3	To mount O3 Estimated Cost: $14.28
Cage System Rods 4" (x4)	Thorlabs	ER4	To mount slit Estimated Cost: $30.76
Cage System Rods 8" (x2)	Thorlabs	ER8	For tube lens alignment Estimated Cost: $25.3
Cage System Rods 12" (x8)	Thorlabs	ER12	For alignment cage Estimated Cost: $145.36
Camera	Andor	Zyla 4.2 sCMOS	Estimated Cost: ~$14,000
Clamping Fork (x35)	Thorlabs	CF125	To clamp down post mounts Estimated Cost: $338.8
Cover Glass, 22 x 22 mm	Corning	2850-22	For slide samples Estimated Cost: $265
Dichroic	AVR	DI01-R405/488/561/635-25×36	To split exciation/emission paths Estimated Cost: $965
Dovetail Translation Stage	Thorlabs	DT12	To translate pinhole Estimated Cost: $90.55
Emission Filter	Thorlabs	FELHO600	Estimated Cost: $140.99
Frosted Glass Alignment Disk (x2)	Thorlabs	DG10-1500-H1	For alignment cage and intermediate plane Estimated Cost: $75.14
Function Generator	Hewlett-Packard	HP 33120A 15 MHz	To control galvo Estimated Cost: $900
Galvanometer – 1D Large Beam Diameter System	Thorlabs	GVS011	Estimated Cost: $1715.78
Galvanometer Power Supply	Siglent	SPD3303C	Estimated Cost: $300
Gelrite	Research Products International	G35020-100.0	Gellan gum for 3D bead sample Estimated Cost: $68.25
FIJI Software	Open-source		Download from https://imagej.net/software/fiji/downloads Estimated Cost: Free
Hot Plate/ Stirrer	Corning	6795-220	For preparing sample solutions Estimated Cost: $550
K-Cube Brushed Motor Controller	Thorlabs	KDC101	Drives Z825B Estimated Cost: $757.51
Kinematic Mount	Thorlabs	KM100S	To mount dichroic Estimated Cost: $92.01
Kinesis Software	Thorlabs		Download from https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Estimated Cost: Free
Laser Light Blocker	Thorlabs	LB1	For ND filter reflections Estimated Cost: $57.65
Laser Mount	custom made		3D printed Estimated Cost: N/A
Laser Safety Screen (x2)	Thorlabs	TPS4	For blocking stray laser light Estimated Cost: $92.02
Laser Scanning Tube Lens	Thorlabs	TTL200MP	TL1 Estimated Cost: $1491
Lens Mount (x10)	Thorlabs	LMR1	To mount all lens and extra alignment mirror. Estimated Cost: $164.7
Magnetic Ruler	Thorlabs	BHM4	To check alignment Estimated Cost: $52.74
Micro-Manager Software	Open-source		Download from https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Estimated Cost: Free
Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	12550400	For slide samples Estimated Cost: $123.9
Microscope Stage	ASI	FTP-2000 with custom parts	To fine-translate samples Estimated Cost: ~$16,000
Mini Vortex Mixer	VWR	10153-688	For sample preparation Estimated Cost: $152.64
Motorized Actuator	Thorlabs	Z825B	To fine-translate M1 Estimated Cost: $729.07
Mounted Standard Iris (x2)	Thorlabs	ID20	At least 2 for alignment Estimated Cost: $118.02
ND Filter Set	Thorlabs	NDK01	To reduce excitation intensity Estimated Cost: $726.73
Objective Lens 1	Nikon	Plan Apo 60X/ 1.20 WI	O1 Estimated Cost: ~$15,000
Objective Lens 2	Nikon	TU Plan Fluor 100X/0.90	O2 Estimated Cost: ~$6,000
Objective Lens 3	Mitutoyo	Plan Apo HR 50X/0.75	O3 Estimated Cost: ~$6,800
OPM Deskewing Software	Open-source		For image processing. Download from https://github.com/QI2lab/OPM Estimated Cost: Free
Photodiode Power Sensor	Thorlabs	S121C	For measuring laser intensity Estimated Cost: $379.68
Positive Grid Distortion Target	Thorlabs	R1L3S3P	Brightfield alignment Estimated Cost: $267.87
Power Meter Digital Console	Thorlabs	PM100D	For measuring laser intensity Estimated Cost: $1245.48
Rhodamine 6G	Thermo Scientific	J62315.14	For fluorescent coated slide sample Estimated Cost: $27.7
Right-Angle Clamp for Posts	Thorlabs	RA90	For M3 support and flip down mirror Estimated Cost: $32.46
RMS-Threaded Cage Plate (x2)	Thorlabs	CP42	For alignment laser Estimated Cost: $70.56
Shear Plate 2.5-5.0 mm	Thorlabs	SI050P	Estimated Cost: $182.85
Shear Plate 5.0-10.0 mm	Thorlabs	SI100P	Estimated Cost: $201.47
Shear Plate 10.0-25.4 mm	Thorlabs	SI254P	Estimated Cost: $236.42
Shear Plate Viewing Screen	Thorlabs	SIVS	Estimated Cost: $337.74
Shearing Interferometer with 1-3 mm Plate	Thorlabs	SI035	For checking collimation Estimated Cost: $465.85
Slip-On Post Collar (x35)	Thorlabs	R2	To maintain post height Estimated Cost: $208.25
Slit	Thorlabs	VA100	Estimated Cost: $294.64
Slotted Lens Tube, 3"	Thorlabs	SM1L30C	For alignment laser Estimated Cost: $77.45
Square Mirror, 1 x 1"			https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069&hvpos=&hvne tw=g&hvrand=1336734911900437 4691&hvpone=&hvptwo=&hvqmt= &hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=& hvlocphy=9031212&hvtargid=pla-1 943952718742&gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB&th=1 Estimated Cost: $14.76
Stackable Lens Tube 1/2" (x3)	Thorlabs	SM1L05	To mount CL1-3 Estimated Cost: $40.86
Stackable Lens Tube 1"	Thorlabs	SM1L10	To mount O3 Estimated Cost: $15.41
Stackable Lens Tube 2" (x2)	Thorlabs	SM1L20	For camera path Estimated Cost: $35.7
Studded Pedestal Base Adapter (x37)	Thorlabs	BE1	To attach post mounts to table Estimated Cost: $400.71
Translating Lens Mount (x3)	Thorlabs	LM1XY	To fine-translate pinhole, O2 and O3 Estimated Cost: $441
Translation Stage with Standard Micrometer (x2)	Thorlabs	PT1/M	TS1-2 Estimated Cost: $647.54
Travel Manual Translation Stage	Thorlabs	CT1A	O3 cage translation mount Estimated Cost: $497.3
Tube Lens	Nikon	MXA20696	TL3 Estimated Cost: $359
White Mounted LED	Thorlabs	MNWHL4	Brightfield light source Estimated Cost: $171.28
			TOTAL ESTIMATED COST: $84,858.98
			The authors note that many parts were bought used. Here, we have attempted to reflect the retail price of all items, so the total cost can be greatly reduced by buying particular items used, especially the more expensive ones.
OPTIONAL COMPONENTS
Grasshopper3 USB3	FLIR	GS3-U3-23S6C-C	For diagnostic checks during alignment. Acquisiton camera can be used instead, but requires realignment afterwards. Estimated Cost: $1089