डिजाइन और cytoskeleton नेटवर्क के दृश्य के लिए एक अनुकूलन योग्य, एकल-उद्देश्य, प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का निर्माण

Summary

यह प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णन करता है कि कैसे एक एकल-उद्देश्य, प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का निर्माण किया जाए और साइटोस्केलेटन नेटवर्क की कल्पना के लिए इसका उपयोग किया जाए।

Abstract

पुनर्गठित साइटोस्केलेटन कंपोजिट गैर-संतुलन नरम पदार्थ के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। इन 3 डी, घने नेटवर्क की गतिशीलता का वफादार कब्जा ऑप्टिकल सेक्शनिंग के लिए कहता है, जो अक्सर प्रतिदीप्ति फोकल माइक्रोस्कोप से जुड़ा होता है। हालांकि, लाइट-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) में हाल के घटनाक्रम ने इसे लागत प्रभावी और कभी-कभी बेहतर विकल्प के रूप में स्थापित किया है। एलएसएफएम को साइटोस्केलेटन शोधकर्ताओं के लिए प्रकाशिकी से कम परिचित बनाने के लिए, हम ऑफ-द-शेल्फ घटकों से एक बहुमुखी प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप बनाने के लिए एक कदम-दर-चरण शुरुआती मार्गदर्शिका प्रस्तुत करते हैं। पारंपरिक स्लाइड नमूनों के साथ नमूना बढ़ते सक्षम करने के लिए, यह एलएसएफएम एकल-उद्देश्य लाइट-शीट (एसओएलएस) डिजाइन का अनुसरण करता है, जो उत्तेजना और उत्सर्जन संग्रह दोनों के लिए एकल उद्देश्य का उपयोग करता है। हम एसओएलएस के प्रत्येक घटक के कार्य का पर्याप्त विस्तार से वर्णन करते हैं ताकि पाठकों को इंस्ट्रूमेंटेशन को संशोधित करने और उनकी विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुरूप इसे डिजाइन करने की अनुमति मिल सके। अंत में, हम किनेसिन-संचालित सूक्ष्मनलिका नेटवर्क में एस्टर्स की कल्पना करके इस कस्टम एसओएलएस उपकरण के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं।

Introduction

लाइट-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीकों के एक परिवार का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें उत्तेजना प्रकाश को शीट ^1,2 में आकार दिया जाता है, जिसमें चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसपीआईएम), भ्रमित रूप से संरेखित प्लानर उत्तेजना (एससीएपीई), और तिरछा-विमान माइक्रोस्कोपी (ओपीएम)^3,4,5,6,7. इस तरह के epi-प्रतिदीप्ति, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM), या confocal माइक्रोस्कोपी के रूप में अन्य माइक्रोस्कोपी तौर-तरीकों के विपरीत, प्रकाश विषाक्तता LSFM में कम से कम है और नमूनों को अब timescales पर imaged किया जा सकता है क्योंकि केवल नमूना के विमान सक्रिय रूप से imaged किया जा रहा है ^8,9,10 प्रबुद्ध है. इसलिए, एलएसएफएम तकनीक विस्तारित समय अवधि में 3 डी नमूनों की इमेजिंग के लिए बेहद उपयोगी हैं, विशेष रूप से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीकों के लिए भी मोटी। इन कारणों के कारण, 2004 में अपने मूल विकास के बाद से, एलएसएफएम इस तरह के जीवित जेब्राफिश और ड्रोसोफिला भ्रूण ^3,4,6,11 के रूप में पूरे जीवों के दृश्य के लिए कई शरीर विज्ञानी, विकासात्मक जीवविज्ञानी, और तंत्रिका विज्ञानियों के लिए पसंद की इमेजिंग तकनीक बन गया है. इन पिछले दो दशकों में, एलएसएफएम के फायदे ऊतक^11,12, सेलुलर, और उपकोशिकीय तराजू सहित, उत्तरोत्तर छोटे पैमाने पर संरचना और गतिशीलता कल्पना करने के लिए लाभ उठाया गया है, दोनों विवो में और इन विट्रो 13,14,15,17 में.

साहित्य में सफल उपयोग के मामलों की रिपोर्ट के बावजूद, वाणिज्यिक एलएसएफएम सिस्टम की उच्च लागत (~ लेखन के समय के रूप में 0.25 मिलियन अमरीकी डालर)^18,19 तकनीक के व्यापक उपयोग को रोकता है। DIY को शोधकर्ताओं के लिए एक व्यवहार्य विकल्प बनाने के लिए, ओपन-एक्सेस प्रयास ओपनएसपीआईएम²² सहित कई बिल्ड गाइड 8,13,20,21 प्रकाशित किए गए हैं। हालांकि, आज तक, न्यूनतम प्रकाशिकी अनुभव वाले शोधकर्ता केवल पहले एलएसएफएम डिजाइनों का उपयोग कर सकते हैं, जो पारंपरिक स्लाइड-माउंटेड नमूने(चित्रा 1ए)के साथ असंगत हैं। हाल ही में एकल-उद्देश्य, लाइट-शीट (एसओएलएस) कार्यान्वयन उत्तेजना और पता लगाने (चित्रा 1सी) दोनों के लिए एक ही उद्देश्य का उपयोग करता है, जिससे संगतता 5,6,8,13,20से संबंधित सीमा पर काबू पा लिया जाता ^है। हालांकि, एसओएलएस डिजाइन की बहुमुखी प्रतिभा के लिए लागत इमेजिंग (चित्रा 1 डी) के लिए कैमरे पर ऑब्जेक्ट प्लेन को रिले, डी-टिल्ट और रीइमेज करने के लिए दो अतिरिक्त उद्देश्यों की आवश्यकता के कारण निर्माण की जटिलता में पर्याप्त वृद्धि है। जटिल एसओएलएस-शैली के सेटअपों तक पहुंच की सुविधा के लिए, यह पेपर स्लाइड-संगत एसओएलएस सिस्टम के डिजाइन, निर्माण, संरेखण प्रक्रिया और उपयोग पर चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रस्तुत करता है, जो केवल एक प्रवेश स्तर के प्रकाशिकी पाठ्यक्रम के ज्ञान वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी होगा।

यद्यपि प्रोटोकॉल स्वयं संक्षिप्त है, पाठकों को डिजाइन या हार्डवेयर विचारों के विशेष भागों के बारे में अधिक जानने के लिए तैयारी के चरणों के दौरान अन्य संसाधनों का उल्लेख करना चाहिए। हालांकि, यदि कोई पाठक इस डिजाइन के विनिर्देशों का पालन करने का इरादा रखता है, तो यह समझना आवश्यक नहीं हो सकता है कि विशेष ऑप्टिकल घटकों का चयन कैसे किया जाए।

चित्रा 1: विभिन्न एलएसएफएम कॉन्फ़िगरेशन के लक्षण। (ए) प्रारंभिक एलएसएफएम डिजाइनों में आम दो ऑर्थोगोनल उद्देश्यों के साथ सेटअप। इस विन्यास में, एक केशिका ट्यूब या जेल के एक सिलेंडर नमूना होता है, जो पारंपरिक स्लाइड बढ़ते तकनीक के साथ संगत नहीं है शामिल करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (बी) एसओएलएस लाइट-शीट डिज़ाइन का एक योजनाबद्ध निम्नलिखित दिखा रहा है: (सी) नमूना विमान (ओ 1) पर उत्तेजना और उत्सर्जन संग्रह दोनों के लिए उपयोग किया जाने वाला एकल उद्देश्य; यह एक पारंपरिक स्लाइड को शीर्ष पर माउंट करने की अनुमति देता है, और (डी) एसओएलएस उत्सर्जन पथ में रिले उद्देश्य प्रणाली। O2 उत्सर्जन प्रकाश एकत्र करता है और छवि को आवर्धित करता है। O3 कैमरा सेंसर पर सही झुकाव कोण पर विमान को चित्रित करता है। संक्षिप्ताक्षर: LSFM = प्रकाश-पत्रक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी; SOLS = एकल-उद्देश्य प्रकाश-पत्रक; O1-O3 = उद्देश्य। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

1. संरेखण के लिए तैयारी निर्माण शुरू करने से पहले, इच्छित उपयोग के मामले का स्पष्ट विचार रखने के लिए किसी भी आवश्यक साहित्य समीक्षा करें (उदाहरण के लिए, फ्लोरोफोर्स को चित्रित किया जाना है, आवश्यक इमेजिंग वॉल्यूम, रिज़ॉल्यूशन आवश्यकताएं)। विशेष रूप से, यह तय करने के लिए नीचे दिए गए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग को देखें कि यहां वर्णित सटीक डिज़ाइन का पालन करना उचित है या नहीं। यदि ऐसा है, तो चरण 1.2 पर जाएं। यदि नहीं, तो हार्डवेयर चयन के लिए सुझाव और मार्गदर्शन प्राप्त करें Sheunglab SOLS बिल्ड गाइड23.नोट: उपयोगकर्ता चर्चा अनुभाग में इस विशेष प्रणाली के विनिर्देशों के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं। सामग्री की तालिका में विस्तृत सभी आवश्यक ऑप्टिकल, ऑप्टो-मैकेनिकल और इलेक्ट्रिकल घटकों को इकट्ठा करें। सिस्टम को संशोधित करने वाले उपयोगकर्ताओं के लिए, सभी समकक्ष भागों को इकट्ठा करें। चित्रा 2 ए में दर्शाया के रूप में संरेखण लेजर का निर्माण. जांचें कि बीम अपरूपण प्लेट का उपयोग करके टकराया गया है। चित्रा 2 बी में दर्शाए गए के रूप में डबल पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क संरेखण पिंजरे का निर्माण। फ्लोरोसेंट डाई-लेपित परीक्षण नमूना तैयार करें।धीरे-धीरे आसुत जल के 1 एमएल को 0.2 ग्राम लियोफिलिज्ड पाउडर में जोड़कर एक संतृप्त रोडामाइन डाई समाधान बनाएं जब तक कि यह सब भंग न हो जाए। समरूप बनाने के लिए भंवर।नोट: यह समाधान प्रकाश के प्रति संवेदनशील है। हालांकि तैयारी के दौरान कोई आवश्यक सावधानी नहीं है, सुनिश्चित करें कि समाधान तैयार होने के बाद एक अंधेरे क्षेत्र में संग्रहीत किया जाता है।चेतावनी: रोडामाइन पाउडर को संभालते समय हमेशा दस्ताने और मास्क पहनें। एक परीक्षण स्लाइड के केंद्र पर पिपेट 10 माइक्रोन। तरल के शीर्ष पर एक 22 मिमी x 22 मिमी कवर ग्लास रखें, यह सुनिश्चित करना कि प्रतिदीप्ति की परत यथासंभव पतली है। स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील।नोट: यह नमूना प्रकाश संवेदनशील है। नमूने के जीवनकाल को अधिकतम करने के लिए, सुनिश्चित करें कि स्लाइड एक अंधेरे क्षेत्र में संग्रहीत है जब यह उपयोग में नहीं है। 3 डी मनका नमूना (1 माइक्रोन जेल में एम्बेडेड मोती) तैयार करें।एक नमूना स्लाइड टेप उच्च की तीन परतों पर एक 4-5 मिमी चौड़ा ऊर्ध्वाधर चैनल बनाने के लिए दो तरफा टेप का प्रयोग करें. स्लाइड के केंद्र में टेप के शीर्ष पर 22 मिमी x 22 मिमी कवर ग्लास रखें। टेप और कवर ग्लास के बीच एक अच्छी सील सुनिश्चित करने के लिए टेप किए गए क्षेत्रों पर मजबूती से दबाएं। अतिरिक्त टेप को हटाने के लिए रेजर ब्लेड का प्रयोग करें। धीरे-धीरे 1 ग्राम गेलन गम पाउडर में डीआई पानी जोड़कर संतृप्त गेलन गम समाधान के 125 एमएल तैयार करें। यह समाधान कमरे के तापमान पर ठोस और 65 डिग्री सेल्सियस पर तरल होगा। एक microcentrifuge ट्यूब में Gellan गम समाधान के 1 एमएल परिचय. 65 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर पानी का एक कंटेनर गरम करें, और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को गर्म करें जब तक कि गेलन गम स्पष्ट रूप से चिपचिपा न हो जाए। गर्म गेलन गम समाधान में मोतियों के 1: 1,000 कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोन तैयार करें। ध्यान से पूर्ण होने तक कक्ष में समाधान विंदुक. चैनल के दोनों किनारों पर थोड़ी मात्रा में एपॉक्सी लगाने के लिए टूथपिक का उपयोग करें, पूरी तरह से सील करने के लिए उद्घाटन को कवर करें। उचित सीलिंग सुनिश्चित करने के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए दोनों सिरों का नेत्रहीन निरीक्षण करें कि एपॉक्सी ने चैनल के प्रत्येक छोर में थोड़ा प्रवेश किया है। चित्रा 2: संरेखण उपकरण की तस्वीरें। (ए) Collimated संरेखण लेजर. AL1: संरेखण लेंस 1, -50 मिमी; AL2: संरेखण लेंस 2, 100 मिमी (बी) डबल पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क संरेखण पिंजरे। संक्षिप्ताक्षर: आरएमएस सीपी = आरएमएस थ्रेडेड पिंजरे की प्लेट; SM1 CP = SM1 थ्रेडेड केज प्लेट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 2. उत्तेजना पथ को संरेखित करना ऑप्टिकल तालिका की सतह पर खुर्दबीन लेआउट बाहर स्केच. सभी दूरियों को यथासंभव सटीक रूप से मापें।नोट: सिस्टम के भीतर घटकों के स्थान के लिए चित्र 3 देखें। मेज पर उत्तेजना लेजर माउंट. लेजर की इच्छित ऊंचाई के लिए दो irises सेट करें, और उन्हें मिरर 1 (एम 1) के स्थान के पीछे छेद की वांछित रेखा पर 2-3 फीट अलग माउंट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए इन irises का उपयोग करें कि बीम टेबल की सतह के साथ समतल है और ऑप्टिकल टेबल पर छेद की रेखा पर केंद्रित है।नोट: आंखों की सुरक्षा के लिए लेजर सुरक्षा चश्मा पहनें, और सुरक्षा एहतियात के रूप में लेजर सुरक्षा स्क्रीन के साथ किसी भी आवारा लेजर बीम को बंद कर दें। जब तक सभी घटकों को स्थायी रूप से क्लैंप नहीं किया जाता है, तब तक घंटों के क्रम में बहाव संभव है। निर्माण पर लौटने पर बहाव के लिए एक त्वरित दृश्य जांच के रूप में प्रत्येक दिन के अंत में संरेखण के सबसे दूर बिंदु पर एक आईरिस सेट करें। कंपन, एक अनुचित रूप से तैरती ऑप्टिकल तालिका, और हवा की धाराएं ऑप्टिकल बहाव के सबसे सामान्य कारण हैं। लेजर शटर को उत्तेजना लेजर के जितना संभव हो उतना करीब माउंट करें। संरेखण के दौरान लेजर लाइट को जल्दी से अवरुद्ध करने के लिए इस शटर का उपयोग करें, बजाय बार-बार लेजर को चालू और बंद करने के। ND फ़िल्टर को ND फ़िल्टर व्हील (ND 0.5, 1.0. 2.0, 3.0, 4.0, और एक रिक्त स्लॉट) में इकट्ठा करें, और लेज़र शटर के बाद माउंट करें। मोटर चालित एक्ट्यूएटर को एक अनुवाद पर स्विच करेंtagई (TS1), और फिर M1 के स्थान के तहत चरण डालें। सुनिश्चित करें कि चरण अक्षीय रूप से छेद की एक ही रेखा के साथ अनुवाद करता है जो लेजर प्रकाश का अनुसरण करता है। प्रारंभिक प्लेसमेंट के लिए इसकी सीमा के बीच में चरण सेट करें।निम्नलिखित चरणों 2.6-2.10 में, तालिका पर खींचे गए पथ के साथ लेजर को निर्देशित करने के लिए एक समय में बीम पथ में परावर्तक ऑप्टिकल घटकों को डालें। वांछित निकास बीम पथ को परिभाषित करने और प्रत्येक चिंतनशील तत्व के प्लेसमेंट और संरेखण का मार्गदर्शन करने के लिए सटीक ऊंचाई पर सेट irises की जोड़ी का उपयोग करें। प्रत्येक तत्व के लिए, माउंट की ऊंचाई और स्थिति को समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि आने वाली बीम केंद्र से टकराती है। फिर, टेबल पर खींचे गए बीम पथ के साथ बीम को निर्देशित करने के लिए माउंट के आधार को घुमाएं ताकि यह दोनों आईरिस से गुजरे, और प्रत्येक माउंट के पीछे नॉब्स के साथ आउटगोइंग बीम के झुकाव को ठीक-समायोजित करें।नोट: प्रत्येक तत्व को सही ऊंचाई पर संरेखित करने के बाद, ऊंचाई को सुरक्षित करने के लिए पोस्ट में एक स्लिप-ऑन कॉलर जोड़ें। TS1 के शीर्ष पर M1 माउंट और संरेखित करें। माउंट करें और डाइक्रोइक को टेबल पर संरेखित करें। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, गैल्वो को बिजली की आपूर्ति और फ़ंक्शन जनरेटर से कनेक्ट करें। गैल्वो को इस तरह माउंट करें कि लेजर दर्पण के सटीक केंद्र पर घटना हो। गैल्वो पर पावर, और फिर मिरर टिल्ट को 0 वी डीसी करंट (रेंज का केंद्र) पर सेट करने के लिए वेवफॉर्म जनरेटर पर एएम बटन को दबाकर रखें। अब, गैल्वो को आईरिस में संरेखित करें। दर्पण 2 (M2) को माउंट और संरेखित करें। बेलनाकार दर्पण माउंट में बड़े बेलनाकार दर्पण डालें। मिरर 3 (M3) के ऊपर 30-60 मिमी केज अडैप्टर संलग्न करने के लिए पिंजरे की छड़ में 1 का उपयोग करें। प्रारंभिक प्लेसमेंट के लिए M3 दर्पण के झुकाव को समतल करने के लिए मिरर माउंट पर नॉब्स का उपयोग करें। एम 3 के ऊपर पिंजरे एडाप्टर में डबल-फ्रॉस्टेड ग्लास संरेखण पिंजरे को माउंट करें; पिंजरे एडाप्टर पर सेट शिकंजा को कसना सुनिश्चित करें जो संरेखण पिंजरे को हर बार संरेखण के लिए उपयोग किए जाने पर पकड़ता है। माउंट M3 को टेबल पर, और ऊंचाई और स्थिति को तब तक समायोजित करें जब तक कि बीम मोटे तौर पर दोनों फ्रॉस्टेड ग्लास संरेखण डिस्क पर केंद्रित न हो जाए। Clamp M3 टेबल पर, और मिरर माउंट के दोनों ओर टेप किए गए छेद का उपयोग करके समर्थन जोड़ने के लिए M3 के दोनों किनारों पर पोस्ट माउंट, 3 इन पोस्ट, 90° क्लैंप और पोस्ट में 2 का उपयोग करें। बीम को ठीक से समायोजित करने के लिए दर्पण के पीछे घुंडी का उपयोग करें।नोट: उत्तेजना पथ में सभी चिंतनशील तत्व अब सेट हैं और छुआ नहीं जाना चाहिए। माउंट लेंस 1 (L1) मेज पर। सभी प्रारंभिक लेंस प्लेसमेंट के लिए, लेंस के सामने आने वाली बीम को केंद्रित करने के लिए स्क्रू-ऑन लेंस लक्ष्य का उपयोग करें। लेंस 1 (L1) के झुकाव और पार्श्व स्थिति को तब तक समायोजित करें जब तक कि बीम M3 के ऊपर संरेखण पिंजरे पर दोनों पाले सेओढ़ लिया ग्लास प्लेटों पर केंद्रित न हो जाए। माउंट लेंस 2 (L2) L4 के साथ एक 4f प्रणाली बनाने के लिए अपनी संबंधित स्थिति में। एक संकुचित बीम प्राप्त करने के लिए अक्षीय रूप से L2 ले जाएँ, और कोलिमेशन की जांच के लिए उत्तेजना लेजर और कतरनी प्लेट का उपयोग करें। एम 3 के ऊपर दोनों पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क पर बीम को केंद्र में रखने के लिए एल 2 के झुकाव और पार्श्व स्थिति को समायोजित करें। पिनहोल को xy ट्रांसलेशन माउंट में माउंट करें। ठीक अक्षीय अनुवाद प्रदान करने के लिए इसे 1 डी अनुवाद चरण के शीर्ष पर माउंट करें। पिनहोल और स्टेज को पोस्ट और पोस्ट माउंट पर माउंट करें, और इसे L1 और L2 के बीच साझा फोकल पॉइंट पर रखें। पिनहोल को हाथ से तब तक समायोजित करें जब तक कि लेजर लाइट को पिनहोल के माध्यम से न देखा जा सके। पिनहोल के तुरंत बाद पावर मीटर सेंसर को माउंट करें, और उत्तेजना लेजर की तरंग दैर्ध्य का चयन करने के लिए बिजली मीटर के डिजिटल कंसोल पर तरंग दैर्ध्य बटन का उपयोग करें। ट्रांसमिशन को अधिकतम करने और निकट TEM00 बीम प्राप्त करने के लिए पिनहोल की xy स्थिति को समायोजित करेंfile. फिर, ट्रांसमिशन को और अधिकतम करने के लिए पिनहोल को अक्षीय रूप से 1D चरण के साथ समायोजित करें। लेंस 4 (L4) को टेबल पर उसकी स्थिति में माउंट करें, और माउंट को सही ऊंचाई पर समायोजित करें। L4 अक्षीय रूप से समायोजित करें ताकि उत्तेजना बीम गैल्वो की सतह पर केंद्रित हो। M3 के ऊपर दोनों पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क पर बीम को केंद्र में रखने के लिए L4 के झुकाव और पार्श्व स्थिति को समायोजित करें। लेंस 3 (L3) को टेबल पर उसकी स्थिति में माउंट करें, और माउंट को सही ऊंचाई पर समायोजित करें। L3 और L4 के टकराव की जांच करने के लिए उत्तेजना लेजर और कतरनी प्लेट का उपयोग करें। एम 3 के ऊपर दोनों पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क पर बीम को केंद्र में रखने के लिए एल 3 के झुकाव और पार्श्व स्थिति को समायोजित करें। अस्थायी रूप से L3 निकालें। माउंट स्कैन लेंस 1 (SL1) मेज पर, और L4 के साथ एक संकुचित दूरबीन बनाने के लिए अक्षीय दूरी को समायोजित करें, जैसा कि कतरनी प्लेट के साथ मापा जाता है। एम 3 के ऊपर दोनों पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क पर बीम को केंद्र में रखने के लिए एसएल 1 के झुकाव और पार्श्व स्थिति को समायोजित करें। L3 पुन्हा घाला. माउंट ट्यूब लेंस 1 (TL1), और SL1 और TL1 को टकराने के लिए उत्तेजना बीम और कतरनी प्लेट का उपयोग करें। एम 3 के ऊपर दोनों पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क पर बीम को केंद्र में रखने के लिए टीएल 1 के झुकाव और पार्श्व स्थिति को समायोजित करें। एडेप्टर रिंग का उपयोग करके, उद्देश्य 1 (O1) को M3 के ऊपर केज प्लेट में स्क्रू करें। SL1 को अस्थायी रूप से निकालें, और बीम को छत से टकराने दें। पिंजरे प्रणाली पर O1 की ऊंचाई (अक्षीय दूरी) को तब तक समायोजित करें जब तक कि बीम छत पर एक हवादार डिस्क न बना ले, और फिर डिस्क के आकार को कम करने तक समायोजन जारी रखें। O1 के साथ, नमूना चरण को उपयुक्त स्थिति में माउंट करें। चित्रा 3: एसओएलएस प्रणाली के भीतर घटकों का स्थान। (ए) लेबल किए गए सभी घटकों के साथ एसओएलएस प्रणाली का योजनाबद्ध लेआउट। (बी) ऑप्टिकल टेबल पर भौतिक एसओएलएस सिस्टम की टॉप-डाउन फोटो, नमूना चरण क्षेत्र को छोड़कर। (सी)नमूना चरण क्षेत्र की टॉप-डाउन फोटो ( चित्रा 3 बी का विस्तार)। उत्तेजना पथ हरे रंग में दिखाया गया है। उत्सर्जन पथ लाल रंग में दिखाया गया है। लेंस की फोकल लंबाई: एल 1: 100 मिमी; एल 2: 45 मिमी; सीएल 1: 50 मिमी; सीएल 2: 200 मिमी; सीएल 3: 100 मिमी; एल 3: 150 मिमी; एल 4: 100 मिमी; एसएल 1: 75 मिमी; टीएल 1: 200 मिमी; एसएल 2: 150 मिमी; टीएल 2: 125 मिमी; टीएल 3: 200 मिमी। अधिक विस्तृत भाग विनिर्देशों के लिए सामग्री की तालिका देखें। संक्षिप्ताक्षर: SOLS = एकल-उद्देश्य प्रकाश-पत्रक; एनडी व्हील = चर तटस्थ घनत्व फिल्टर व्हील; एल 1-एल 4 = प्लानो अवतल एक्रोमैट लेंस; CL1-CL3 = बेलनाकार लेंस; एम 1-एम 3 = दर्पण; TS1-TS2 = अनुवाद चरण; डीएम = डाइक्रोइक दर्पण; गैल्वो = स्कैनिंग गैल्वेनोमीटर; SL1-SL2 = स्कैन लेंस; TL1-TL2 = ट्यूब लेंस; O1-O3 = उद्देश्य; EF = उत्सर्जन फिल्टर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 3. उत्सर्जन पथ को संरेखित करना संरेखण लेजर सेट करें।लेजर के रूप में एक ही ऊंचाई पर उत्तेजना लेजर बगल में दो खाली पिंजरे प्लेटों माउंट. दो पिंजरे प्लेटों में खाली छेद में संरेखण लेजर के पिंजरे छड़ फिसलने से संरेखण लेजर माउंट करने के लिए इन पिंजरे प्लेटों का प्रयोग करें. सुनिश्चित करें कि लेजर को चालू स्थिति में सेट किया जा सकता है, या तो पावर बटन के चारों ओर टैप करके या चालू/बंद स्विच को वायर करके। O1 निकालें, और पाले सेओढ़ लिया गिलास संरेखण पिंजरे को फिर से डालें। उत्तेजना बीम पथ के लिए संरेखण बीम संरेखित करने के लिए एक कीनेमेटिक दर्पण माउंट और एक ड्रॉप डाउन दर्पण का प्रयोग करें. दो दर्पणों को ठीक से समायोजित करके पिनहोल के बाद संरेखण बीम के संकेत को अधिकतम करने के लिए बिजली मीटर का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि बीम पाले सेओढ़ लिया गिलास संरेखण पिंजरे पर केंद्रित रहता है। संरेखण पिंजरे निकालें, और O1 डालें। चौकोर दर्पण को O1 के नमूना चरण पर रखें, और दर्पण को अक्षीय रूप से समायोजित करें जब तक कि बीम प्रोफ़ाइल का आकार डाइक्रोइक के बाद कम से कम न हो जाए। उत्सर्जन पथ में एक आईरिस माउंट करें और काफी पीछे जाएं ताकि स्कैन लेंस 2 (एसएल 2), ट्यूब लेंस 2 (टीएल 2), और उद्देश्य 2 (ओ 2) को हस्तक्षेप के बिना डाला जा सके। संरेखण लेजर के लिए इस परितारिका संरेखित करें. आईरिस के पीछे कम से कम 1 पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क माउंट करें, और सुनिश्चित करें कि यह लेजर प्रकाश से भी जुड़ा हुआ है। SL2 को सही दूरी पर डालें, जैसा कि एक शासक के साथ गैल्वो से मापा जाता है। SL2 के झुकाव और पार्श्व स्थिति को समायोजित करें ताकि आने वाली संरेखण बीम SL2 पर केंद्रित हो और आउटगोइंग बीम आईरिस और फ्रॉस्टेड ग्लास डिस्क से गुजरे। TL2 को सही दूरी पर डालें, जैसा कि SL2 से मापनी के साथ किया जाता है। टीएल 2 के झुकाव और पार्श्व स्थिति को समायोजित करें ताकि आने वाली संरेखण बीम टीएल 2 पर केंद्रित हो और आउटगोइंग बीम आईरिस और फ्रॉस्टेड ग्लास डिस्क से गुजरे। टेबल पर TS2 माउंट करें। सुनिश्चित करें कि चरण O2 के ऑप्टिकल अक्ष के साथ अनुवाद करता है। एक xy अनुवाद माउंट पर O2 पेंच. अनुवाद चरण पर O2 माउंट करने के लिए xy माउंट के नीचे एक पोस्ट कनेक्ट करें। लाल लेजर पर O2 के पीछे केंद्र में एक पेंच-ऑन लक्ष्य का उपयोग करें। xy knobs और O2 के झुकाव को समायोजित करें ताकि लाल संरेखण बीम परितारिका और पाले सेओढ़ लिया गिलास डिस्क के माध्यम से गुजरता है. संरेखण लेजर को O1 से ऊपर ले जाएं और उत्सर्जन पथ में नीचे की ओर निर्देशित करें। लेजर चालू करें, और सुनिश्चित करें कि यह बीम उत्सर्जन पथ के सभी लेंसों पर केंद्रित है। आईरिस खोलकर और पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क को हटाकर ओ 1 और ओ 2 के पुतली विमानों को संयुग्मित करें ताकि ओ 2 से बाहर निकलने वाला संरेखण बीम दूर की सतह या दीवार (>0.5 मीटर) (चित्रा 4) के लिए अबाधित जारी रहे। TS2 को तब तक समायोजित करें जब तक कि बीम सतह पर एक छोटी हवादार डिस्क न बना ले, और फिर हवादार डिस्क के आकार को कम करने के लिए TS2 को समायोजित करना जारी रखें।नोट: एक दृढ़ता से अपसारी बीम O2 के गलत स्थान को इंगित करता है। हालांकि, क्योंकि यह बीम दो उद्देश्यों से गुजरता है, विचलन की एक छोटी मात्रा अंतर्निहित है। जैसे, एरी डिस्क सबसे अच्छा मार्गदर्शक है। झुकाव-अपरिवर्तनीय स्कैनिंग के लिए गैल्वो का अनुकूलन करें: गैल्वो के लिए त्रिकोण तरंग संकेत का चयन करने के लिए तरंग जनरेटर पर एफएसके बटन दबाएं, और कम आवृत्ति (~ 1 हर्ट्ज) पर सेट करें। उसी दूर की सतह या दीवार पर संरेखण बीम का निरीक्षण करें।नोट: यदि गैल्वो को गलत तरीके से रखा गया है, तो बीम गैल्वो आंदोलन के साथ सतह पर क्षैतिज रूप से स्वीप करेगा। इसे गैल्वो बेस के झुकाव और xy स्थिति के ठीक समायोजन (हाथ से) के माध्यम से हल किया जा सकता है जब तक कि बीम विस्थापन आंख से ज्ञानी नहीं होता है। 0 डिग्री पर इमेजिंग द्वारा प्रणाली की गुणवत्ता की जाँच करें.एक xy अनुवाद माउंट में O3 पेंच. पिंजरे अनुवाद चरण में लेंस ट्यूब में 1 पेंच, और ट्यूब में xy अनुवाद चरण पेंच. पिंजरे अनुवाद चरण के सामने को पिंजरे की प्लेट से जोड़ने के लिए दो पिंजरे की छड़ का उपयोग करें, और पिंजरे की प्लेट को एक पोस्ट पर माउंट करें। माउंट उद्देश्य 3 (O3) O2 (~ 4-5 मिमी) के सामने 0 डिग्री पर, और मिलान करने के लिए ऊंचाई समायोजित करें। SL2 और TL2 के बीच साझा फोकल प्लेन में एक पाले सेओढ़ लिया ग्लास संरेखण डिस्क माउंट करें, जैसा कि एक शासक के साथ मापा जाता है। मंच पर ऐक्रेलिक फ्लोरोसेंट परीक्षण स्लाइड माउंट, और उत्तेजना लेजर के साथ स्लाइड रोशन. O3 के पीछे से देखें, उत्सर्जन प्रकाश खोजने के लिए O3 की ऊंचाई और अक्षीय स्थिति दोनों को समायोजित करें, और फिर O3 अक्षीय रूप से समायोजित करें जब तक कि उत्सर्जन प्रकाश बैक एपर्चर(चित्रा 5)को भर न दे। O3 अनुवाद चरण के पीछे पिंजरे की छड़ में दो 8 पेंच. छड़ पर एक घुड़सवार पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क के साथ एक पिंजरे की प्लेट स्लाइड करें, और फिर xy माउंट का उपयोग करके O3 को ठीक-समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि उत्सर्जन प्रकाश O3 केंद्रित से बाहर निकलता है। फिर, पिंजरे की छड़ें हटा दें। कैमरा सेंसर की खुरदरी स्थिति में एक पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क माउंट करें, और उत्सर्जन प्रकाश के लिए डिस्क की ऊंचाई और स्थिति को संरेखित करें। ट्यूब लेंस 3 (TL3) को एक पिंजरे की प्लेट में पेंच करें, और इसे तुरंत O3 के पीछे माउंट करें। आने वाले उत्सर्जन प्रकाश पर TL3 को केंद्र में रखें, और फिर जावक प्रकाश को पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क पर संरेखित करने के लिए TL3 के झुकाव को समायोजित करें। कैमरे को ट्यूब लेंस से सही दूरी पर माउंट करें, जैसा कि एक मापनी के साथ मापा जाता है। लेंस ट्यूब में 2 और कैमरे पर उत्सर्जन फिल्टर दोनों को स्क्रू करें। SL2 और TL2 के बीच साझा फोकल प्लेन में पाले सेओढ़ लिया ग्लास संरेखण डिस्क रिमाउंट करें। फ्लोरोसेंट डाई परीक्षण नमूना माउंट करें, और उत्तेजना बीम के साथ नमूना रोशन करें। कैमरा चालू करें, और उसके बाद कनेक्टेड कंप्यूटर पर Micromanager प्रोग्राम खोलें। लाइव दृश्य दर्ज करने के लिए लाइव पर क्लिक करें। प्रारंभिक एक्सपोज़र सेटिंग्स सेट करने के लिए ऑटो वन्स पर क्लिक करें, और फिर इमेजिंग करते समय आवश्यकतानुसार एक्सपोज़र को रीसेट करें।नोट: माइक्रोमैनेजर तब तक ठीक से काम नहीं करेगा जब तक कि कैमरा चालू होने के बाद इसे खोला न जाए। O3 माउंट पर xy अनुवाद नॉब्स को तब तक समायोजित करें जब तक कि ग्लास संरेखण डिस्क में छोटा छेद दृश्य क्षेत्र (FoV) के भीतर केंद्रित न हो जाए। O3 अक्षीय रूप से पिंजरे अनुवाद चरण के साथ समायोजित करें जब तक कि छेद फोकस में न हो; किनारों को तेज दिखाई देना चाहिए (चित्र 6)। सिस्टम की गुणवत्ता की जांच करने के लिए छवि फ्लोरोसेंट मोती। पाले सेओढ़ लिया ग्लास संरेखण डिस्क निकालें, 3 डी मनका नमूना माउंट, और उत्तेजना बीम के साथ नमूना रोशन. O1 के सापेक्ष नमूने की ऊंचाई को समायोजित करें जब तक कि फ्लोरोसेंट मोती FoV के केंद्र में एक गोलाकार क्षेत्र को न भर दें। xy चरण और अक्षीय अनुवाद चरण का उपयोग करके O3 की स्थिति को ठीक से समायोजित करें जब तक कि बिंदु प्रसार कार्य (पीएसएफ) गोल (न्यूनतम विपथन का संकेत) और उज्ज्वल (एक अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात का संकेत)(चित्रा 7) न हों। यदि यह O3 को समायोजित करके प्राप्त नहीं किया जा सकता है, तो यह अत्यधिक संभावना है कि घटकों O1 और O2 के बीच ऑप्टिकल सिस्टम उप-इष्टतम रूप से संरेखित है; नीचे चरण 3.13 में नैदानिक जाँच का पालन करें। यदि गोल पीएसएफ प्राप्त किया जा सकता है, तो नैदानिक चरण को छोड़ दें, और इमेजिंग सिस्टम को झुकाने के लिए आगे बढ़ें। यदि आवश्यक हो तो नैदानिक जांच करें।नोट: एक बार अच्छा पीएसएफ प्राप्त हो जाने के बाद, बाकी नैदानिक चरणों को छोड़ दिया जा सकता है।ब्राइटफील्ड (BF) लाइट को O1 के ऊपर माउंट करें। संरेखण दर्पण के रूप में एक ही अक्षीय ऊंचाई पर नमूना चरण पर सकारात्मक ग्रिड परीक्षण लक्ष्य माउंट. 10 माइक्रोन ग्रिड केंद्र, और बीएफ प्रकाश के साथ ग्रिड रोशन. कैमरे पर ग्रिड की छवि बनाएं, और ग्रिड के फ़ोकस में होने तक नमूने का अनुवाद करें। ग्रिड छवि का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए करें कि FoV के पार का क्षेत्र सपाट है: यदि नहीं, तो ग्रिड विकृत और झुका हुआ दिखाई देगा। खराब ग्रिड छवि के लिए सही करने के लिए, xyz स्थिति और O3 के झुकाव को समायोजित करें, और फिर TL3 और कैमरे को तदनुसार समायोजित करें।नोट: यदि एक फ्लैट ग्रिड प्राप्त किया जा सकता है, तो चरण 3.12.10 दोहराएं, और फिर इमेजिंग सिस्टम को झुकाने के लिए आगे बढ़ें। संरेखण कैमरा या इमेजिंग कैमरा को सही दूरी पर सेट करें ताकि SL2 छवि को सेंसर पर केंद्रित करे। मध्यवर्ती विमान (चित्रा 8) पर ग्रिड लक्ष्य छवि. यदि यह ग्रिड भी तिरछा है, तो यह अत्यधिक संभावना है कि घटकों O1 और SL2 के बीच ऑप्टिकल सिस्टम उप-इष्टतम रूप से संरेखित है और इसे फिर से देखा जाना चाहिए। प्रगति से पहले आवश्यकतानुसार संरेखण का अनुकूलन करें।नोट: यदि कैमरा SL2 और TL2 के बीच में फ़िट नहीं होता है, तो SL2 के बाद और कैमरे पर छवि को 90° बाउंस करने के लिए एक अतिरिक्त दर्पण का उपयोग करें। मध्यवर्ती विमान पर पीएसएफ की जांच करें: ग्रिड की जांच करने के बाद, एक और अच्छी नैदानिक जांच एक ही मध्यवर्ती विमान पर पीएसएफ की जांच करना है। इस विमान पर एक अच्छी छवि, जो चित्रा 7 के समान है, लेकिन एक अलग आवर्धन (चित्रा 9) पर, एसएल 2 के माध्यम से अच्छा संरेखण इंगित करता है।नोट: यदि मध्यवर्ती विमान पर एक फ्लैट ग्रिड और गोल पीएसएफ प्राप्त किया जा सकता है, तो चरण 3.13.2 दोहराएं, फिर चरण 3.12.10, और फिर इमेजिंग सिस्टम को झुकाने के लिए आगे बढ़ें। O3 इमेजिंग उप-प्रणाली को 30° पर झुकाएं।O3, TL3 और कैमरा निकालें। एक गाइड के रूप में मेज पर लाइनों का उपयोग करके O3 को O2 के ऑप्टिकल अक्ष पर 30° पर पुनः सम्मिलित करें। SL2 और TL2 के बीच साझा फोकल प्लेन में एक पाले सेओढ़ लिया ग्लास संरेखण डिस्क माउंट. मंच पर ऐक्रेलिक फ्लोरोसेंट परीक्षण स्लाइड माउंट, और उत्तेजना लेजर के साथ स्लाइड रोशन. एक बार फिर, O3 के पीछे से देखें, उत्सर्जन प्रकाश को 30° पर खोजने के लिए O3 की ऊंचाई और अक्षीय स्थिति दोनों को समायोजित करें, और फिर O3 अक्षीय रूप से तब तक समायोजित करें जब तक कि उत्सर्जन प्रकाश पीछे के एपर्चर को भर न दे। एक मजबूत उत्सर्जन संकेत प्राप्त करने के लिए SL2 और TL2 के बीच से पाले सेओढ़ लिया ग्लास संरेखण डिस्क निकालें। O3 अनुवाद चरण के पीछे पिंजरे की छड़ में दो 8 पेंच. छड़ पर एक घुड़सवार पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क के साथ एक पिंजरे की प्लेट स्लाइड करें, और फिर xy माउंट का उपयोग करके O3 को ठीक-समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि उत्सर्जन प्रकाश O3 केंद्रित से बाहर निकलता है। फिर, पिंजरे की छड़ें हटा दें। कैमरा सेंसर की खुरदरी स्थिति में एक पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क माउंट करें, और उत्सर्जन प्रकाश के लिए डिस्क की ऊंचाई और स्थिति को संरेखित करें। माउंट TL3 तुरंत O3 के पीछे। आने वाले उत्सर्जन प्रकाश पर TL3 को केंद्र में रखें, और फिर जावक प्रकाश को पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क पर संरेखित करने के लिए TL3 के झुकाव को समायोजित करें। TL3-कॅमेरा अंतर अधिक अचूकते, O3 काळजीपूर्वक काळजीपूर्वक काढा आणि संरेखण लेझर माउंट करा जेणेकरून टीएल3 द्वारे कॅमेऱ्यावर केंद्रित असले. आवश्यकतानुसार एनडी फिल्टर का उपयोग करें ताकि लेजर की तीव्रता <1 मेगावाट हो। कैमरा लाइव प्रारंभ करें view, और कैमरे पर लेजर स्पॉट को कम करने के लिए TL3 अक्षीय रूप से समायोजित करें। SL2 और TL2 के बीच साझा फोकल प्लेन में पाले सेओढ़ लिया ग्लास संरेखण डिस्क रिमाउंट करें। फ्लोरोसेंट डाई परीक्षण नमूना माउंट करें, और उत्तेजना बीम के साथ नमूना रोशन करें। O3 माउंट पर xy अनुवाद नॉब्स को तब तक समायोजित करें जब तक कि ग्लास संरेखण डिस्क में छोटा छेद कैमरे पर FoV के भीतर न हो। ओ 3 अक्षीय रूप से स्थानांतरित करने के लिए पिंजरे अनुवाद चरण को समायोजित करें जब तक कि छेद फोकस में न हो; सुनिश्चित करें कि छेद 0° पर जैसा दिखता है, वैसा ही दिखाई देता है। एक ही अक्षीय ऊंचाई पर सकारात्मक ग्रिड परीक्षण लक्ष्य रिमाउंट करें, और बीएफ प्रकाश के साथ ग्रिड को रोशन करें। पुष्टि करें कि केवल एक लंबवत खंड फोकस में है (30 ° झुकाव के कारण)। एक बार फिर, ग्रिड छवि का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए करें कि फ़ोक से बाहर होने पर भी FoV का क्षेत्र सपाट है। जब स्लाइड अक्षीय रूप से अनुवादित होती है, तो पुष्टि करें कि FoV (ग्रिड लक्ष्य) का इन-फ़ोकस भाग स्क्रीन पर क्षैतिज रूप से स्वीप करता है, जबकि ग्रिड वर्ग एक सुसंगत आकार बनाए रखते हैं (चित्र 10)।नोट: नमूने पर इमेजिंग विमान के झुकाव के कारण, ग्रिड एक्स-प्लेन में थोड़ा फैला हुआ दिखाई दे सकता है। चित्रा 4: लेजर-इन-लेजर-आउट तकनीक। O1 के सामने से एक संकुचित परीक्षण बीम भेजना और दूर की सतह पर O2 से बाहर निकलने वाली बीम का अवलोकन करना। यदि सभी घटकों को सही दूरी पर संरेखित किया जाता है, तो बीम दूर की सतह पर एक छोटी हवादार डिस्क बनाएगा। सभी संक्षिप्ताक्षर चित्र 3 के समान हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 5: संरेखण के लिए उत्सर्जन प्रकाश का उपयोग। (ए) ओ 2 के बीएफपी के पीछे एक स्क्रू-ऑन लक्ष्य पर ऐक्रेलिक फ्लोरोसेंट स्लाइड से उत्सर्जन प्रकाश। (B) O3 के पिछले भाग से दृष्टि द्वारा उत्सर्जन प्रकाश ज्ञात करना। संक्षिप्ताक्षर: O2-O3 = उद्देश्य; BFP = बैक फोकल प्लेन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 6: सही ढंग से केंद्रित पाले सेओढ़ लिया ग्लास संरेखण डिस्क की ऑन-कैमरा छवि। डिस्क को SL2 और TL2 के बीच मध्यवर्ती विमान पर रखा गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: SL2 = स्कैन लेंस; TL2 = ट्यूब लेंस। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 7: 3 डी मनका नमूना की कैमरा छवि। छवि इमेजिंग मॉड्यूल 0 डिग्री पर सेट के साथ 1 एनएम मोती दिखाती है और बेलनाकार लेंस के सम्मिलन से पहले एक परिपत्र बीम द्वारा प्रकाशित होती है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 8: सकारात्मक ग्रिड परीक्षण लक्ष्य सही ढंग से एसएल 2 और टीएल 2 के बीच मध्यवर्ती विमान पर केंद्रित है। क्षेत्र की संपूर्णता में फ्लैट ग्रिड घटकों SL2 और पूर्व के अच्छे संरेखण का संकेत देते हैं। स्केल बार = 30 माइक्रोन. संक्षिप्ताक्षर: SL2 = स्कैन लेंस; TL2 = ट्यूब लेंस। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 9: 3 डी मनका नमूने की कैमरा छवि। छवि एसएल 2 और टीएल 2 के बीच मध्यवर्ती विमान पर सही ढंग से केंद्रित 1 एनएम मोती दिखाती है। स्केल बार = 30 माइक्रोन. संक्षिप्ताक्षर: SL2 = स्कैन लेंस; TL2 = ट्यूब लेंस। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 10: ग्रिड के वर्गों से मेल खाने के लिए लगातार आकार के पीले वर्ग के साथ सकारात्मक ग्रिड परीक्षण लक्ष्य। (ए) बाईं ओर फोकस में ग्रिड। (बी) दाईं ओर फोकस में ग्रिड। पीला वर्ग FoV के दोनों किनारों पर ग्रिड बॉक्स के आकार से मेल खाता है। स्केल बार = 30 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम = FoV = देखने का क्षेत्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 4. तिरछी प्रकाश शीट को संरेखित करना O1 निकालें, और इसके स्थान पर डबल पाले सेओढ़ लिया गिलास संरेखण पिंजरे फिर से डालें। पुष्टि करें कि बीम कोलिमेट किया गया है और दोनों पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क पर केंद्रित है। बेलनाकार लेंस 1 (CL1) को घूर्णन लेंस माउंट में पेंच करें। ऑप्टिकल पथ में सीएल 1 माउंट करें, और माउंट को घुमाएं ताकि बीम ऑप्टिकल टेबल के ऊर्ध्वाधर दिशा में विस्तारित हो। सीएल 1 के झुकाव और पार्श्व स्थिति को समायोजित करें ताकि बीम सामने की तरफ केंद्रित हो और दोनों पाले सेओढ़ लिया ग्लास डिस्क पर केंद्रित स्थिति बनाए रखे। बेलनाकार लेंस 2 (CL2) को एक घूर्णन लेंस माउंट में पेंच करें, और CL2 के साथ 4f सिस्टम बनाने के लिए सही दूरी पर ऑप्टिकल पथ में CL1 माउंट करें। सीएल 2 को सीएल 1 के समान अभिविन्यास में घुमाएं ताकि बीम ऑप्टिकल टेबल के ऊर्ध्वाधर दिशा में फैला हो और टकरा जाए। बेलनाकार बीम प्रोफ़ाइल की ऊंचाई को मापने के लिए कई स्थानों पर एक परीक्षण कार्ड का उपयोग करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि बीम टकराया गया है। सीएल 2 के झुकाव और पार्श्व स्थिति को समायोजित करें, जैसा कि चरण 4.2 में किया गया है। बेलनाकार लेंस 3 (CL3) को एक घूर्णन लेंस माउंट में पेंच करें, और L3 के साथ 4f सिस्टम बनाने के लिए सही दूरी पर ऑप्टिकल पथ में CL3 को माउंट करें। सीएल 3 को सीएल 1 और सीएल 2 दोनों के समान अभिविन्यास में घुमाएं ताकि बीम फोकल प्लेन पर एक क्षैतिज शीट प्रोफाइल पर केंद्रित हो। सीएल 3 के झुकाव और पार्श्व स्थिति को समायोजित करें, जैसा कि चरण 4.2 में किया गया है। भट्ठा डालें: पिंजरे की छड़ में चार 4 और CL3 पिंजरे के माउंट का उपयोग करके, सीएल 3 और एल 3 के बीच फोकल प्लेन पर एक ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में भट्ठा को माउंट करें, जैसा कि एक शासक के साथ मापा जाता है। स्लिट की ऊंचाई और पार्श्व स्थिति को समायोजित करने के लिए स्ट्रेच्ड उत्तेजना बीम प्रोफाइल का उपयोग करें जब तक कि यह बीम पर केंद्रित न हो। ओ 1 को फिर से डालें, फ्लोरोसेंट डाई परीक्षण नमूना माउंट करें, और उत्तेजना प्रकाश शीट के साथ नमूना रोशन करें। कैमरा सेंसर पर, पुष्टि करें कि 0° लाइट शीट पतली लंबवत शीट (चित्र 11A) के रूप में दिखाई देती है। फ्लोरोसेंट डाई परीक्षण नमूना निकालें, और ओ 1 साफ मिटा दें। प्रकाश शीट को O1 से ऊपर अबाधित रूप से विस्तार करने दें। मोटर चालित अनुवाद चरण नियंत्रण का उपयोग करके, M1 को बेलनाकार लेंस की ओर अनुवाद करें ताकि प्रकाश शीट के कोण को O1 के ऑप्टिकल अक्ष के सापेक्ष लगभग 60° पर सेट किया जा सके।नोट: यह महत्वपूर्ण है कि प्रकाश शीट सही दिशा में झुका हुआ है समान रूप से झुका हुआ इमेजिंग विमान (चित्रा 12) के साथ संरेखित करने के लिए; यदि एक प्रणाली को इस विशिष्ट डिजाइन से अलग तरीके से रखा गया है, तो ज्यामितीय किरण अनुरेखण के माध्यम से झुकाव की सही दिशा का पता लगाया जा सकता है।नोट: संदर्भ के लिए, भट्ठा की ओर M1 2.647 मिमी का अनुवाद करने से लाइट शीट को इस सेटअप में सही झुकाव पर सेट किया गया है। झुका हुआ शीट छवि करने के लिए फ्लोरोसेंट डाई परीक्षण नमूना फिर से डालें. सुनिश्चित करें कि प्रकाश शीट ने कैमरे पर एक ऊर्ध्वाधर बीम आकार बनाए रखा है लेकिन व्यापक और धुंधला है (चित्र 11B)। मंच के साथ अक्षीय नमूना अनुवाद इतना है कि फ्लोरोसेंट डाई FoV के केंद्र और स्क्रीन के दाहिने हाथ की ओर के बीच पांच अलग अलग गहराई पर प्रकाश चादर से रोशन है. प्रत्येक छवि को सहेजें। फिजी में छवियों को खोलें। प्रत्येक छवि के लिए, लाइन टूल का चयन करें, और FoV के केंद्र से लाइट शीट के केंद्र तक एक क्षैतिज रेखा खींचें। विस्थापन को मापने के लिए, विश्लेषण पर जाएं | लाइनों की लंबाई देखने के लिए माप. फिर, O1 के ऊपर प्रकाश शीट के कोण की गणना करने के लिए नमूना गहराई के एक समारोह के रूप में प्रकाश शीट के विस्थापन की साजिश रच. M1 का थोड़ा अनुवाद करें। चरण 4.9 और चरण 4.10 को दोहराएं जब तक कि प्रकाश शीट का कोण इमेजिंग विमान के कोण से मेल खाते हुए, O1 के ऑप्टिकल अक्ष से 60 डिग्री न हो। चित्रा 11: फ्लोरोसेंट डाई परीक्षण नमूने की कैमरा छवियां एक सही आकार की प्रकाश शीट द्वारा प्रकाशित। (ए) 90 डिग्री पर शीट, सीधे ओ 1 के ऑप्टिकल अक्ष के साथ ऊपर, और (बी) 30 डिग्री (ओ 1 के ऑप्टिकल अक्ष के लिए 60 डिग्री) तक झुका हुआ है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। संक्षिप्त: O1 = उद्देश्य। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 12: ओ 1 के इमेजिंग विमान के साथ संरेखित करने के लिए प्रकाश-शीट झुकाव की सही दिशा। संक्षिप्ताक्षर: O1-O3 = उद्देश्य। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 5. इमेजिंग और डेटा संग्रह के लिए सिस्टम को फाइन-ट्यूनिंग करना 3D मनका स्लाइड माउंट करें, और नमूने को अक्षीय रूप से मंच के साथ अनुवाद करें जब तक कि मोती कैमरे पर FoV को न भर दें। xy चरण और पिंजरे अनुवाद चरण का उपयोग करके O3 को समायोजित करें, जिसका लक्ष्य विपथन को कम करना और छवि में सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अनुकूलित करना है (चित्र 13)। O1 के सुधार कॉलर को समायोजित करें, जिसका लक्ष्य विपथन को कम करना और छवि में सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अनुकूलित करना है। चित्रा 13: 3 डी मनका नमूना (1 माइक्रोन मोती) की कैमरा छवियों को सही ढंग से आकार की प्रकाश शीट द्वारा प्रकाशित किया गया है। (ए) 90 डिग्री पर शीट, सीधे ओ 1 के ऑप्टिकल अक्ष के साथ, और (बी) ओ 1 के ऑप्टिकल अक्ष पर 30 डिग्री तक झुका हुआ। पीला बॉक्स FoV के उस हिस्से को इंगित करता है जो सपाट, सुसंगत और प्रयोग करने योग्य (80 μm x 80 μm) है और जिसमें विश्वसनीय डेटा कैप्चर किया जा सकता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: O1 = उद्देश्य; FoV = देखने का क्षेत्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 6. सिस्टम के आवर्धन को कैलिब्रेट करना नमूना चरण पर सकारात्मक ग्रिड परीक्षण लक्ष्य माउंट करें, और ब्राइटफील्ड लाइट के साथ रोशन करें। ग्रिड स्लाइड को फोकस में लाने के लिए स्टेज के साथ अक्षीय रूप से ग्रिड स्लाइड का अनुवाद करें। ग्रिड के केंद्र को फोकस में लाएं। छवि कैप्चर करें और सहेजें, और फिर इसे फिजी में खोलें। पिक्सल में दो ग्रिड लाइनों के बीच की दूरी को सटीक रूप से मापने के लिए फिजी में लाइन टूल और माप फ़ंक्शन का उपयोग करें। पिक्सेल-टू-माइक्रोन अंशांकन निर्धारित करने के लिए ज्ञात दूरी (10 माइक्रोन) से इस मान को विभाजित करें। पिक्सेल के मापा आकार और समीकरण (1) के साथ पिक्सेल के ज्ञात आकार का उपयोग करके सिस्टम के आवर्धन (एम) की गणना करें।(1) 7. वॉल्यूमेट्रिक स्कैन प्राप्त करना नमूना रखें।कैमरा पूर्वावलोकन, गैल्वो, फ़ंक्शन जनरेटर, बिजली की आपूर्ति, स्टेज और उत्तेजना लेजर चालू करें। नमूना माउंट करें, और फिर त्रिकोण तरंग सेट करने के लिए फ़ंक्शन जनरेटर पर FSK बटन पर क्लिक करें। नमूना खोजने के लिए, निम्नलिखित सेट करने के लिए फ़ंक्शन जनरेटर का उपयोग करें: 400 एमवी पीक-टू-पीक आयाम (का उपयोग करना Ampl. बटन), 0 ऑफ़सेट (ऑफ़सेट बटन का उपयोग करके), और 200 mHz आवृत्ति। 100 एमएस एक्सपोजर समय निर्धारित करने के लिए माइक्रोमैनेजर विंडो का उपयोग करें। नमूना विमान तक पहुँचने तक मैन्युअल रूप से z में स्क्रॉल करें। z सेटिंग को ऑप्टिमाइज़ करें ताकि वॉल्यूमेट्रिक स्कैन के लिए वांछित क्षेत्र एक चक्र के दौरान स्क्रीन से होकर गुजरे। स्कैन पैरामीटर का चयन करें।सुनिश्चित करें कि पीक-टू-पीक आयाम नेत्रहीन जाँच करके सही ढंग से सेट किया गया है कि पूर्वावलोकन स्कैन की अवधि के लिए फ़ोकस में दिखता है। यदि छवि गुणवत्ता स्कैन के एक छोर पर दूसरे की तुलना में जल्द ही खराब हो जाती है, तो स्कैन के केंद्र को बेहतर क्षेत्र की ओर ले जाने के लिए फ़ंक्शन जनरेटर पर ऑफ़सेट को संपादित करें। Micromanager कार्यक्रम में, एक जोखिम समय का चयन करें, और बहु आयामी अधिग्रहण खिड़की खोलने के लिए मल्टी डी Acq पर क्लिक करें. फ़्रेम की संख्या चुनने के लिए गणना बॉक्स का उपयोग करें, जो कुल प्राप्ति समय निर्धारित करेगा। फ़्रेम के बीच का अंतराल (फ़्रेम दर) एक्सपोज़र समय द्वारा सेट किया जाएगा जब तक कि अंतराल बॉक्स में लंबा अंतराल निर्दिष्ट न किया गया हो। फ़ंक्शन जनरेटर पर, त्रिकोण तरंग फ़ंक्शन (एक दिशा में रैखिक स्कैन) की अवधि के आधे हिस्से से पूर्ण वॉल्यूम स्कैन बनाने के लिए आवृत्ति सेट करें।नोट: यदि फ्रेम दर और आवृत्ति बहुत कम है, तो वॉल्यूम स्कैन के लिए बहुत कम फ्रेम प्राप्त किए जाएंगे, और कम फ्रेम संख्या पोस्ट-प्रोसेसिंग में दृश्यमान कलाकृतियों का निर्माण करेगी। संदर्भ के लिए, चित्रा 13 स्कैन में ~ 100 फ्रेम से बना था, और चित्रा 14 ~ 800 से बना था। मापदंडों का चयन करते समय नमूने पर विचार करना भी महत्वपूर्ण है। सुनिश्चित करें कि एक्सपोज़र का समय निर्धारित किया गया है ताकि नमूना पर्याप्त रूप से उत्साहित हो लेकिन संतृप्त न हो। उत्तेजना लेजर तीव्रता भी इस अंत करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. यदि उपयोगकर्ता 3D में समय-भिन्न प्रक्रिया को चिह्नित करने के लिए वॉल्यूमेट्रिक स्कैन की एक श्रृंखला प्राप्त कर रहा है, तो सुनिश्चित करें कि स्कैनिंग टाइमस्केल सिस्टम की टाइमस्केल गतिशीलता से अधिक है। वीडियो एकत्र करना: एक समय-चूक प्राप्त करें जो वॉल्यूम के एक पूर्ण स्कैन के अनुरूप त्रिकोण तरंग के कम से कम पूर्ण रैंप अप या रैंप डाउन की अवधि को कैप्चर करता है। 8. पोस्ट-प्रोसेसिंग प्रक्रियाएं डेस्कविंग वॉल्यूमेट्रिक इमेज स्टैकवॉल्यूम स्कैन को झुका हुआ विमानों में छवियों के ढेर को वास्तविक xyz निर्देशांक में छवियों की एक श्रृंखला में बदलने के लिए स्कैन करता है।नोट: मौजूदा वॉल्यूम स्कैन के डेस्कविंग को करने के साथ-साथ डेस्कविंग करने और अधिग्रहण24 के दौरान डेस्क छवियों को बचाने के लिए लाइट-शीट इमेज पोस्ट-प्रोसेसिंग और ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर पर कई उत्कृष्ट गाइड मौजूद हैं। वॉल्यूम स्कैन को डेस्क करने के लिए, निम्नलिखित दो पैरामीटर प्राप्त करें: पिक्सेल (डी) में दो फ्रेम के बीच वास्तविक दूरी, और फ्रेम प्लेन और एक्स-वाई प्लेन के बीच का कोण (θ तिरछी लाइट शीट के कोण द्वारा सेट किया गया है (इस प्रणाली में, 30°)। फ्रेम के बीच की दूरी इमेजिंग प्रकाशिकी और अधिग्रहण सेटिंग्स पर निर्भर करेगा। d पैरामीटर पता करनाहर बार सिस्टम को काफी हद तक पुन: संरेखित करने के लिए फ्रेम के बीच की दूरी को कैलिब्रेट करें। फ्लोरोसेंट मोती की छवियों का एक ढेर के साथ इस अंशांकन प्रदर्शन, के रूप में इन मुद्दों के निदान के लिए उपयोग करने के लिए सबसे आसान कर रहे हैं. छवियों का एक ढेर प्राप्त करें, और डी पैरामीटर के लिए किसी भी प्रारंभिक अनुमान का उपयोग करके डेस्कविंग कोड चलाएं। ImageJ में deskewed छवि स्टैक खोलें, और स्टैक के माध्यम से स्क्रॉल करें। यदि d को उसके वास्तविक मान से काफी दूर सेट किया गया है, तो ध्यान दें कि मोती कृत्रिम रूप से x या y में लम्बी दिखाई देंगे, और अलग-अलग मोती xy विमान में चलते हुए दिखाई देंगे क्योंकि उपयोगकर्ता z में फ़्रेम के माध्यम से स्क्रॉल करता है (एक ही केंद्रीय बिंदु से ध्यान केंद्रित करने और डिफ़ोकसिंग करने के बजाय)। d पैरामीटर पर कई बार पुनरावृति करें जब तक कि ये समस्याएँ अब स्पष्ट न हों। एक बार डी पैरामीटर यथोचित सही मूल्य के करीब होने के लिए प्रकट होता है, एक्स और वाई दिशाओं के साथ छवि ढेर की अधिकतम तीव्रता अनुमानों की गणना. ध्यान दें कि विवर्तन सीमा के पास एक व्यास के मोती z में लम्बी दिखाई दे सकते हैं, लेकिन वे आदर्श शंक्वाकार दिखाई नहीं देना चाहिए या तिरछे लम्बी होना चाहिए. डेस्कविंग मापदंडों को तब तक फाइन-ट्यून करें जब तक कि ये मानदंड नए पुनरावृत्तियों के साथ पर्याप्त रूप से सुधार न करें। संदर्भ के लिए, चित्रा 13 में दिखाया गया डेटा डी = 2.50 पिक्सल पर deskewed थे, और चित्रा 14 में डेटा डी = 1.0 पिक्सल पर deskewed थे.नोट: फ्रेम के बीच की दूरी स्कैन आयाम, आवृत्ति और फ्रेम दर पर रैखिक रूप से निर्भर करेगी।

Representative Results

हमने गेलन गम में एम्बेडेड 1 माइक्रोन मोतियों के वॉल्यूमेट्रिक स्कैन किए। चित्रा 14 एक्स, वाई, और जेड दिशाओं के साथ डेस्केड वॉल्यूमेट्रिक स्कैन की अधिकतम तीव्रता अनुमानों को दर्शाता है। चित्रा 14: गेलन गम में 1 माइक्रोन फ्लोरोसेंट मोतियों की वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग। डेस्कवेड वॉल्यूमेट्रिक स्कैन के अधिकतम तीव्रता अनुमान दिखाए जाते हैं। स्केल सलाखों = 30 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। हमने सूक्ष्मनलिका एस्टर्स के नमूनों के वॉल्यूमेट्रिक स्कैन करके पुनर्गठित साइटोस्केलेटन नेटवर्क को चिह्नित करने के लिए एकल-उद्देश्य, प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप के उपयोग का प्रदर्शन किया है। संक्षेप में, रोडामाइन-लेबल, टैक्सोल-स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं जीटीपी द्वारा पुनर्गठित डिमर से पोलीमराइज़ किए गए थे; फिर, पोलीमराइजेशन के बाद, स्ट्रेप्टाविडिन-आधारित किनेसिन मोटर क्लस्टर को 6 माइक्रोन सूक्ष्मनलिकाएं, 0.5 माइक्रोन किन्सिन डिमर और 10 एमएम एटीपी की अंतिम सांद्रता के लिए एटीपी के साथ नमूनों में मिलाया गया। टैक्सॉल-स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं और किन्सिन मोटर क्लस्टर की तैयारी के लिए व्यापक प्रोटोकॉल और गाइड मिचसन लैब और डोजिक लैब वेबसाइटों 25,26पर पाए जा सकते हैं। नमूनों को माइक्रोस्कोप स्लाइड में धीरे से पाइप किया गया, सील किया गया, और इमेजिंग से पहले 8 घंटे तक बैठने की अनुमति दी गई ताकि मोटर गतिविधि को रोकने की अनुमति मिल सके ताकि नमूने एक स्थिर संरचनात्मक स्थिति तक पहुंच सकें जो एस्टर जैसा दिखता था। पुनर्गठित साइटोस्केलेटन सिस्टम के अध्ययन सबसे अधिक बार छवि लेबल फिलामेंट्स के लिए कॉन्फोकल या एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को नियोजित करते हैं। हालांकि, इन तकनीकों के दोनों छवि घने 3 डी नमूने27 करने के लिए अपनी क्षमता में सीमित हैं. जबकि इन विट्रो साइटोस्केलेटन आधारित सक्रिय पदार्थ अनुसंधान में बहुत प्रगति की गई है, नमूनों को अर्ध 2 डी28,29 होने के लिए विवश करके, साइटोस्केलेटन नेटवर्क स्वाभाविक रूप से 3 डी हैं, और कई वर्तमान प्रयास उन प्रभावों को समझने में झूठ बोलते हैं जो केवल 3 डी नमूनों में उत्पन्न हो सकते हैं29,30, इस प्रकार उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी इमेजिंग की आवश्यकता पैदा करते हैं। चित्रा 15: एकल-उद्देश्य प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी द्वारा पुनर्गठित साइटोस्केलेटन नमूनों के 3 डी दृश्य की सुविधा। (ए) एक लीका डीएमआई 8 लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर अधिग्रहित फ्लोरोसेंट सूक्ष्मनलिका एस्टर की छवियां। चित्र जेड-स्कैन से विभिन्न विमानों को दिखाते हैं। स्केल बार = 30 माइक्रोन। (बी) एक ही नमूने के एकल-उद्देश्य प्रकाश-शीट सेटअप पर किए गए वॉल्यूमेट्रिक स्कैन से डेकोनवल्ड डेस्क छवियां। स्केल बार = 30 माइक्रोन. यहां डेस्क छवि क्षेत्र चित्रा 13 बी में प्रदर्शित प्रयोग करने योग्य एफओवी (पीला बॉक्स) से मेल खाता है। जबकि कवरस्लिप के पास एकल विमानों की इमेजिंग में कॉन्फोकल एक्सेल होता है, फ्लोरोसेंट नमूने का घनत्व इमेजिंग विमान के नीचे से अतिरिक्त संकेत के कारण उच्च विमानों पर इमेजिंग करते समय जटिलताओं का परिचय देता है। प्रकाश शीट केवल इमेजिंग विमान को रोशन करके इस मुद्दे को दरकिनार करती है, इस प्रकार जेड में विभिन्न विमानों पर समान रूप से तेज इमेजिंग की अनुमति देती है। संक्षिप्ताक्षर: SOLS = एकल-उद्देश्य प्रकाश-पत्रक; FoV = देखने का क्षेत्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 15 में, हम किन्सिन मोटर समूहों द्वारा एस्टर जैसी संरचनाओं में अनुबंधित एक पुनर्गठित सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग का प्रदर्शन करते हैं। जैसा कि पिछले शोध 28,31में दिखाया गया है, ये 3 डी संरचनाएं केंद्र की ओर घनी हो जाती हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति के उज्ज्वल क्षेत्र होते हैं जो सिग्नल में प्रमुख होते हैं। कवरस्लिप (कम जेड स्तर) के पास इमेजिंग विमानों में, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 15ए)ऊपर से आउट-ऑफ-फोकस प्रतिदीप्ति संकेतों के कारण केंद्र की ओर अतिरिक्त पृष्ठभूमि के साथ, एस्टर की परिधि के आसपास एकल फिलामेंट्स को हल कर सकता है। हालांकि, जेड में कुछ माइक्रोन को स्थानांतरित करने से छवियों की गुणवत्ता कम हो जाती है क्योंकि एस्टर के आउट-ऑफ-फोकस घने खंड इमेजिंग विमान में सिग्नल में प्रमुख होते हैं। प्रकाश पत्रक (चित्रा 15 बी) की एकल विमान रोशनी इमेजिंग विमान के ऊपर और नीचे एस्टर के घने हिस्सों से आउट-ऑफ-फोकस संकेतों को समाप्त करती है, इस प्रकार विमानों के बीच तुलनीय छवि गुणवत्ता की अनुमति देती है। उच्च गुणवत्ता वाले, विश्वसनीय वॉल्यूमेट्रिक स्कैन डेटा का उत्पादन करने की प्रकाश शीट की क्षमता पुनर्गठित साइटोस्केलेटन सिस्टम में 3 डी घटनाओं की कल्पना और लक्षण वर्णन की संभावना को खोलती है।

Discussion

इस प्रोटोकॉल के बारे में दो महत्वपूर्ण विवरण सिस्टम की समग्र लागत और अपेक्षित निर्माण और संरेखण समय हैं। हालांकि सटीक लागत परिवर्तनशील है, हम आराम से अनुमान लगा सकते हैं कि इस एसओएलएस या इसी तरह के DIY सिस्टम की कुल लागत $ 85,000 अमरीकी डालर की सीमा में आएगी। हम ध्यान दें कि यह अनुमान सभी घटकों के खुदरा मूल्य पर विचार करता है, इसलिए उपयोग किए गए घटकों की सोर्सिंग द्वारा इस समग्र मूल्य को बहुत कम किया जा सकता है। निर्माण समय के संदर्भ में, 1-2 महीने के भीतर इस पूरे एसओएलएस सिस्टम को बनाने और संरेखित करने के लिए छोटे प्रकाशिकी अनुभव वाले उपयोगकर्ता से अपेक्षा करना उचित होगा, बशर्ते कि सभी घटक उपलब्ध और तैयार हों। प्रोटोकॉल की लंबाई और जटिलता के बावजूद, हम मानते हैं कि लिखित पांडुलिपि में विस्तार की मात्रा, वीडियो प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा गया, इस प्रोटोकॉल को सीधा और पालन करने के लिए तेज़ बनाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम हैं. सबसे पहले, गैल्वो का प्लेसमेंट कई लेंसों की नियुक्ति को निर्धारित करता है क्योंकि यह तीन अलग-अलग 4f लेंस जोड़े का हिस्सा है। यह महत्वपूर्ण है कि गैल्वो ओ 1 और ओ 2 के पीछे फोकल विमानों के साथ संयुग्मित है और झुकाव-अपरिवर्तनीय स्कैनिंग सुनिश्चित करने के लिए सही ढंग से केंद्रित है। दूसरा, छवि गुणवत्ता एक दूसरे के संबंध में O2 और O3 के संरेखण के प्रति बेहद संवेदनशील है। यहां, यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि, पहले, O3 से O2 का संरेखण कोण उत्तेजना प्रकाश शीट के झुकाव से मेल खाता है, इस प्रकार समान रूप से झुका हुआ FoV में अधिकतम सपाट रोशनी प्रदान करता है। दूसरा, O3 को यथासंभव बड़े क्षेत्र के साथ एक फ्लैट FoV बनाए रखने के लिए सही अक्षीय दूरी पर रखा जाना चाहिए। तीसरा, O3 को O2-O2 इंटरफ़ेस से गुजरने वाले सिग्नल को अधिकतम करने के लिए O2 से सही पार्श्व दूरी पर रखा जाना चाहिए।

प्रयोग करने योग्य FoV के संदर्भ में, इस प्रणाली ने 80 माइक्रोन x 80 माइक्रोन क्षेत्र में लगातार रोशनी के साथ एक फ्लैट, विश्वसनीय क्षेत्र हासिल किया। यह क्षेत्र कैमरे द्वारा प्रदान किए गए अधिकतम FoV से छोटा है, इसलिए प्रयोग करने योग्य FoV को चित्र 13 में पीले बॉक्स द्वारा इंगित किया गया है। संकल्प शक्ति के संदर्भ में, इस प्रणाली ने x-अक्ष के साथ 432 एनएम और y-अक्ष के साथ 421 एनएम की न्यूनतम समाधान योग्य दूरी हासिल की, जिसे गाऊसी के औसत सिग्मा x और y को बिंदु प्रसार कार्यों (PSFs) में खोजने और दो से गुणा करके मापा गया था। हम ध्यान दें कि इस प्रणाली को इसके कुल एनए के संदर्भ में अनुकूलित नहीं किया गया था, जिसका अर्थ है कि यदि उपयोगकर्ता इस प्रणाली को प्राप्त करने की तुलना में अधिक संकल्प शक्ति चाहते हैं तो महत्वपूर्ण सुधार के लिए जगह है। एसओएलएस निर्माण के इस प्रकार के लिए संगत उद्देश्य विकल्पों की एक भीड़ है, जिनमें से कई एक उच्च प्रणाली संकल्प के लिए योगदान होगा, लेकिन एक उच्च लागत की कमियों के साथ, एक छोटे FoV, या रिले इंटरफ़ेस 8,11,13,20 पर अधिक जटिल संरेखण तकनीकों. अलग-अलग, उपयोगकर्ताओं को एक बड़ा FoV की इच्छा होनी चाहिए, 2D स्कैनिंग की अनुमति देने के लिए एक दूसरे गैल्वो को शामिल करना इस लक्ष्य को प्राप्त करेगा, लेकिन अतिरिक्त प्रकाशिकी और नियंत्रण यांत्रिकी को डिजाइन³² में एकीकृत करने की आवश्यकता होगी। हमने अपनी वेबसाइट पेज पर सिस्टम में संशोधन के बारे में अधिक जानकारी प्रदान की है, डिजाइन प्रक्रिया²³ के बारे में अन्य सहायक संसाधनों के लिंक के साथ।

इस विशेष डिजाइन के लिए विशिष्ट घटकों में सुधार करने से परे, इस निर्माण में अन्य उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकों या तौर-तरीकों को जोड़ना बहुत संभव होगा। ऐसा ही एक सुधार बहु-तरंग दैर्ध्य रोशनी को शामिल करना होगा, जिसमें मूल उत्तेजना पथ⁸ के लिए अतिरिक्त उत्तेजना लेजर को संरेखित करना शामिल होगा। इसके अलावा, क्योंकि एसओएलएस डिजाइन के इस प्रकार नमूना सुलभ छोड़ देता है, माइक्रोस्कोप के लिए अतिरिक्त कार्यों को जोड़ने, लेकिन ऑप्टिकल चिमटी, microfluidics, और रुमेट्री तक सीमित, अपेक्षाकृत सरल ^2,33 है.

प्रकाशित किए गए असंख्य लाइट-शीट गाइड की तुलना में, यह प्रोटोकॉल समझ के स्तर पर निर्देश प्रदान करता है कि महत्वपूर्ण प्रकाशिकी अनुभव के बिना उपयोगकर्ता सहायक हो सकता है। पारंपरिक नमूना स्लाइड माउंटिंग क्षमताओं के साथ उपयोगकर्ता के अनुकूल एसओएलएस को बड़े दर्शकों के लिए सुलभ बनाकर, हम उन सभी क्षेत्रों में एसओएलएस-आधारित अनुसंधान के अनुप्रयोगों के और भी विस्तार को सक्षम करने की उम्मीद करते हैं जिनमें उपकरण का उपयोग किया जा सकता है या किया जा सकता है। यहां तक कि एसओएलएस उपकरणों के अनुप्रयोगों के तेजी से संख्या ^2,34,35 में बढ़ने के साथ, हम मानते हैं कि एसओएलएस-प्रकार के उपकरणों के कई लाभ और उपयोग अभी भी अस्पष्टीकृत हैं और इस प्रकार के उपकरण के आगे बढ़ने की संभावनाओं पर उत्साह व्यक्त करते हैं।

Materials

1" Plano-Concave Lens f = -50 mm	Thorlabs	LC1715-A-ML	For alignment laser Estimated Cost: $49.5
1" Achromatic Doublet f = 100 mm (x3)	Thorlabs	AC254-100-A-ML	L2, L4 and alignment laser Estimated Cost: $342.42
1" Achromatic Doublet f = 125 mm	Thorlabs	AC254-125-A-ML	SL2 Estimated Cost: $114.14
1" Achromatic Doublet f = 150 mm	Thorlabs	AC254-150-A-ML	L3 Estimated Cost: $114.14
1" Achromatic Doublet f = 150 mm	Thorlabs	AC254-150-A-ML	TL2 Estimated Cost: $114.14
1" Achromatic Doublet f = 45 mm	Thorlabs	AC254-045-A-ML	L1 Estimated Cost: $114.14
1" Achromatic Doublet f = 75 mm	Thorlabs	AC254-075-A-ML	SL1 Estimated Cost: $114.14
1" Cylindrical Lens f = 100 mm	Thorlabs	LJ1567RM	CL3 Estimated Cost: $117.62
1" Cylindrical Lens f = 200 mm	Thorlabs	LJ1653RM	CL2 Estimated Cost: $111.22
1" Cylindrical Lens f = 50 mm	Thorlabs	LJ1695RM	CL1 Estimated Cost: $117.62
1" Mounted Pinhole, 30 µm Pinhole Diameter	Thorlabs	P30K	Estimated Cost: $77.08
1" Silver Mirror (x3)	Thorlabs	PF10-03-P01	M1, M2, one for alignment Estimated Cost: $168.78
2" Elliptical Mirror	Thorlabs	PFE20-P01	M3 Estimated Cost: $179.98
2" Post Holder (x11)	Thorlabs	PH2	For custom laser mount, ND wheel, safety screens Estimated Cost: $98.45
2" Posts (x47)	Thorlabs	TR2	For custom laser mount and optical components Estimated Cost: $277.3
3" Posts (x4)	Thorlabs	TR3	For M3 supports and other mounts Estimated Cost: $24.6
3" Post Holder (x4)	Thorlabs	PH3	Estimated Cost: $38.48
30 to 60 mm Cage Adapter	Thorlabs	LCP33	To mount O1 Estimated Cost: $45.42
30mm Cage Filter Wheel	Thorlabs	CFW6	To mount ND filters Estimated Cost: $172.36
30mm Cage Plate (x6)	Thorlabs	CP33	To build alignment cage and alignment laser Estimated Cost: $114.54
30mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount (x3)	Thorlabs	KCB1	To mount M1 and M2 and for alignment laser Estimated Cost: $463.95
4" Post Holder (x30)	Thorlabs	PH4	Estimated Cost: $320.1
561 nm Laser and Power Supply	Opto Engine LLC	MGL-FN-561-100mW	Excitation laser Estimated Cost: $6000
60mm Cage Plate (x2)	Thorlabs	LCP01	To mount TL1 and M3 mount Estimated Cost: $88.52
60mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount	Thorlabs	KCB2	To mount M3 Estimated Cost: $187.26
90° Flip Mount	Thorlabs	TRF90	For alignment laser Estimated Cost: $95.5
Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads	Thorlabs	SM1A9	To connect lens tube to camera Estimated Cost: $20.96
Adapter with External SM1 Threads and Internal C-Mount Threads	Thorlabs	SM1A10	To connect tube lens to lens mount Estimated Cost: $21.82
Adapter with External SM1 Threads and Internal M25 Threads (x2)	Thorlabs	SM1A12	To mount O1 and O2 Estimated Cost: $47.06
Adapter with External SM1 Threads and Internal M26 Threads	Thorlabs	SM1A27	To mount O3 Estimated Cost: $22.38
Alignment Disk	Thorlabs	SM1A7	Estimated Cost: $20.45
Alignment Laser	BISKEE		https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Estimated Cost: $16.98
Autoluorescent Plastic Slide, Red	Chroma	92001	Estimated Cost: $20
Beam Shutter	Thorlabs	SM1SH1	To block laser light Estimated Cost: $65.8
Cage Rotation Mount (x3)	Thorlabs	CRM1T	To mount CL1-3 Estimated Cost: $282.15
Cage System Rods 1" (x8)	Thorlabs	ER1	To mount M3 and O1 Estimated Cost: $44.8
Cage System Rods 3" (x2)	Thorlabs	ER3	To mount O3 Estimated Cost: $14.28
Cage System Rods 4" (x4)	Thorlabs	ER4	To mount slit Estimated Cost: $30.76
Cage System Rods 8" (x2)	Thorlabs	ER8	For tube lens alignment Estimated Cost: $25.3
Cage System Rods 12" (x8)	Thorlabs	ER12	For alignment cage Estimated Cost: $145.36
Camera	Andor	Zyla 4.2 sCMOS	Estimated Cost: ~$14,000
Clamping Fork (x35)	Thorlabs	CF125	To clamp down post mounts Estimated Cost: $338.8
Cover Glass, 22 x 22 mm	Corning	2850-22	For slide samples Estimated Cost: $265
Dichroic	AVR	DI01-R405/488/561/635-25×36	To split exciation/emission paths Estimated Cost: $965
Dovetail Translation Stage	Thorlabs	DT12	To translate pinhole Estimated Cost: $90.55
Emission Filter	Thorlabs	FELHO600	Estimated Cost: $140.99
Frosted Glass Alignment Disk (x2)	Thorlabs	DG10-1500-H1	For alignment cage and intermediate plane Estimated Cost: $75.14
Function Generator	Hewlett-Packard	HP 33120A 15 MHz	To control galvo Estimated Cost: $900
Galvanometer – 1D Large Beam Diameter System	Thorlabs	GVS011	Estimated Cost: $1715.78
Galvanometer Power Supply	Siglent	SPD3303C	Estimated Cost: $300
Gelrite	Research Products International	G35020-100.0	Gellan gum for 3D bead sample Estimated Cost: $68.25
FIJI Software	Open-source		Download from https://imagej.net/software/fiji/downloads Estimated Cost: Free
Hot Plate/ Stirrer	Corning	6795-220	For preparing sample solutions Estimated Cost: $550
K-Cube Brushed Motor Controller	Thorlabs	KDC101	Drives Z825B Estimated Cost: $757.51
Kinematic Mount	Thorlabs	KM100S	To mount dichroic Estimated Cost: $92.01
Kinesis Software	Thorlabs		Download from https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Estimated Cost: Free
Laser Light Blocker	Thorlabs	LB1	For ND filter reflections Estimated Cost: $57.65
Laser Mount	custom made		3D printed Estimated Cost: N/A
Laser Safety Screen (x2)	Thorlabs	TPS4	For blocking stray laser light Estimated Cost: $92.02
Laser Scanning Tube Lens	Thorlabs	TTL200MP	TL1 Estimated Cost: $1491
Lens Mount (x10)	Thorlabs	LMR1	To mount all lens and extra alignment mirror. Estimated Cost: $164.7
Magnetic Ruler	Thorlabs	BHM4	To check alignment Estimated Cost: $52.74
Micro-Manager Software	Open-source		Download from https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Estimated Cost: Free
Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	12550400	For slide samples Estimated Cost: $123.9
Microscope Stage	ASI	FTP-2000 with custom parts	To fine-translate samples Estimated Cost: ~$16,000
Mini Vortex Mixer	VWR	10153-688	For sample preparation Estimated Cost: $152.64
Motorized Actuator	Thorlabs	Z825B	To fine-translate M1 Estimated Cost: $729.07
Mounted Standard Iris (x2)	Thorlabs	ID20	At least 2 for alignment Estimated Cost: $118.02
ND Filter Set	Thorlabs	NDK01	To reduce excitation intensity Estimated Cost: $726.73
Objective Lens 1	Nikon	Plan Apo 60X/ 1.20 WI	O1 Estimated Cost: ~$15,000
Objective Lens 2	Nikon	TU Plan Fluor 100X/0.90	O2 Estimated Cost: ~$6,000
Objective Lens 3	Mitutoyo	Plan Apo HR 50X/0.75	O3 Estimated Cost: ~$6,800
OPM Deskewing Software	Open-source		For image processing. Download from https://github.com/QI2lab/OPM Estimated Cost: Free
Photodiode Power Sensor	Thorlabs	S121C	For measuring laser intensity Estimated Cost: $379.68
Positive Grid Distortion Target	Thorlabs	R1L3S3P	Brightfield alignment Estimated Cost: $267.87
Power Meter Digital Console	Thorlabs	PM100D	For measuring laser intensity Estimated Cost: $1245.48
Rhodamine 6G	Thermo Scientific	J62315.14	For fluorescent coated slide sample Estimated Cost: $27.7
Right-Angle Clamp for Posts	Thorlabs	RA90	For M3 support and flip down mirror Estimated Cost: $32.46
RMS-Threaded Cage Plate (x2)	Thorlabs	CP42	For alignment laser Estimated Cost: $70.56
Shear Plate 2.5-5.0 mm	Thorlabs	SI050P	Estimated Cost: $182.85
Shear Plate 5.0-10.0 mm	Thorlabs	SI100P	Estimated Cost: $201.47
Shear Plate 10.0-25.4 mm	Thorlabs	SI254P	Estimated Cost: $236.42
Shear Plate Viewing Screen	Thorlabs	SIVS	Estimated Cost: $337.74
Shearing Interferometer with 1-3 mm Plate	Thorlabs	SI035	For checking collimation Estimated Cost: $465.85
Slip-On Post Collar (x35)	Thorlabs	R2	To maintain post height Estimated Cost: $208.25
Slit	Thorlabs	VA100	Estimated Cost: $294.64
Slotted Lens Tube, 3"	Thorlabs	SM1L30C	For alignment laser Estimated Cost: $77.45
Square Mirror, 1 x 1"			https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069&hvpos=&hvne tw=g&hvrand=1336734911900437 4691&hvpone=&hvptwo=&hvqmt= &hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=& hvlocphy=9031212&hvtargid=pla-1 943952718742&gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB&th=1 Estimated Cost: $14.76
Stackable Lens Tube 1/2" (x3)	Thorlabs	SM1L05	To mount CL1-3 Estimated Cost: $40.86
Stackable Lens Tube 1"	Thorlabs	SM1L10	To mount O3 Estimated Cost: $15.41
Stackable Lens Tube 2" (x2)	Thorlabs	SM1L20	For camera path Estimated Cost: $35.7
Studded Pedestal Base Adapter (x37)	Thorlabs	BE1	To attach post mounts to table Estimated Cost: $400.71
Translating Lens Mount (x3)	Thorlabs	LM1XY	To fine-translate pinhole, O2 and O3 Estimated Cost: $441
Translation Stage with Standard Micrometer (x2)	Thorlabs	PT1/M	TS1-2 Estimated Cost: $647.54
Travel Manual Translation Stage	Thorlabs	CT1A	O3 cage translation mount Estimated Cost: $497.3
Tube Lens	Nikon	MXA20696	TL3 Estimated Cost: $359
White Mounted LED	Thorlabs	MNWHL4	Brightfield light source Estimated Cost: $171.28
			TOTAL ESTIMATED COST: $84,858.98
			The authors note that many parts were bought used. Here, we have attempted to reflect the retail price of all items, so the total cost can be greatly reduced by buying particular items used, especially the more expensive ones.
OPTIONAL COMPONENTS
Grasshopper3 USB3	FLIR	GS3-U3-23S6C-C	For diagnostic checks during alignment. Acquisiton camera can be used instead, but requires realignment afterwards. Estimated Cost: $1089