Summary

実験的自己免疫性脳脊髄炎における自己抗原の免疫原性増強における 抗酸菌パラ結核の アジュバント活性

Published: May 12, 2023
doi:

Summary

ここでは、加熱死菌菌アビウム亜種パラ結核を含む不完全フロイントアジュバントに懸濁した免疫原性エピトープミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55を使用して、C57BL/6マウスで実験的自己免疫性脳脊髄炎を積極的に誘導するための代替プロトコルを提示します。

Abstract

ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質(MOG)によって誘発される実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、不活化 結核菌を含む完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化したMOGペプチドによる免疫を必要とします。マイコバクテリウムの抗原成分は樹状細胞を活性化してT細胞を刺激し、トール様受容体 を介して Th1応答を促進するサイトカインを産生します。したがって、抗原チャレンジ中に存在するマイコバクテリアの量と種は、EAEの発生に直接関係しています。このメソッド論文は、加熱死菌ア ビウム 亜種 パラ結核 株K-10を含む改変不完全フロイントアジュバントを使用してC57BL/6マウスにEAEを誘導するための代替プロトコルを提示します。

マイコバクテリウム・アビウム複合体のメンバーであるM.パラ結核は、反芻動物のヨーネ病の原因物質であり、多発性硬化症を含むいくつかのヒトT細胞媒介性疾患の危険因子として同定されています。全体として、抗酸菌パラ結核を免疫したマウスは、結核菌H37Ra株を含むCFAを同じ用量の4 mg / mLで免疫したマウスよりも発症が早く、疾患の重症度が高かった。マイコバクテリウム・アビウム亜種パラ結核(MAP)株K-10の抗原決定基は、Tリンパ球(CD4+ CD27+)、樹状細胞(CD11c+ I-A/I-E+)、および単球(CD11b+ CD115+)の数が有意に多いことを特徴とする、エフェクター期に強力なTh1細胞応答を誘導することができました)CFAで免疫したマウスと比較した脾臓における。さらに、MOGペプチドに対する増殖性T細胞応答は、M.パラ結核免疫マウスで最も高かったようです。製剤中のパラ結核菌を含むアジュバント中で乳化された脳炎原(例えば、MOG35-55)の使用は、EAEの誘導段階でミエリンエピトープ特異的CD4+ T細胞をプライミングするための樹状細胞を活性化するための代替的かつ検証された方法であり得る。

Introduction

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、ヒト脱髄障害の研究のための一般的なモデルです1。EAEにはいくつかのモデルがある:強力なアジュバントと組み合わせた異なるミエリンペプチドを用いた能動免疫、ミエリン特異的CD4+リンパ球のin vitro導入による受動免疫、および自発的EAE2のトランスジェニックモデル。これらの各モデルには、発症期、エフェクター期、慢性期など、EAEのさまざまな側面を研究できる特定の機能があります。EAEのミエリン希突起膠細胞糖タンパク質(MOG)モデルは、単核炎症浸潤、末梢白質における脱髄、および疾患ピーク1後の回復の低下を特徴とするため、慢性神経炎症および脱髄の免疫媒介メカニズムを研究するための優れたモデルです。

MOG-EAEは、完全フロイントアジュバント(CFA)中のペプチドMOG35-55 で感受性マウスを免疫し、続いて百日咳毒素を腹腔内注射することによって誘導されます。これにより、血液脳関門の透過性が高まり、末梢で活性化されたミエリン特異的T細胞が中枢神経系(CNS)に到達し、そこで再活性化されます3。CFAは、抗原提示細胞による抗原の取り込みと、体液性および細胞を介した応答に関連するサイトカインの発現を増強することにより、EAEの誘導に重要な役割を果たします4。このメカニズムは、主に油中に乳化された 結核 菌の死滅の存在によるものであり、その成分は免疫系に強い刺激を与える5。実際、EAEの誘導は、抗原チャレンジ6中に存在するマイコバクテリウムの量に直接関係しています。

不完全なフロイントアジュバント7へのマイコバクテリウム・ブチリカムなどの他の死滅抗酸菌の添加、およびアジュバントの組み合わせ8の効果は、EAEの臨床経過を調節し、その結果結果の再現性に影響を与える可能性があります。反芻動物のヨーネ病の病因物質であるマイコバクテリウム・アビウム亜種パラ結核(MAP)は、その抗原成分が多発性硬化症および視神経脊髄炎スペクトラム障害の患者において強力な体液性および細胞性応答を誘発することができるため、ヒトCNS9の炎症性疾患と関連している9。したがって、このプロトコルでは、CFAの結核菌をパラ結核菌に置き換えることにより、MOG-EAEを誘導するための代替的で再現性のある方法を示します。

Protocol

すべてのマウス実験は、順天堂大学医学部の施設動物管理使用委員会(承認番号290238)によって承認され、国立衛生研究所の動物実験ガイドラインに従って実施されました。 1.実験に関する一般的なコメント 動物施設の個々のケージにマウスを、23°C±2°C、湿度50%±10%の制御された病原体のない条件下で、餌と水への 自由摂取 を伴う12時間の明暗?…

Representative Results

C57BL/6マウスの群(合計n = 15/群)を、パラ結核菌を含むエマルジョン中のMOG35-55で、またはCFAとの一般的な方法で免疫した。マウスのすべてのグループは、14〜17日で観察された障害の単一のピークを特徴とする急性単相性疾患を示し、その後10日間にわたって症状が部分的に回復しました(図1A)。パラ結核菌を含むアジュバント?…

Discussion

パラ結核菌10を含むアジュバントで乳化したペプチドMOG35-55を使用して、C57BL / 6Jマウスで重度のEAEを積極的に誘導するための堅牢な代替プロトコルを実証しました。この方法によるEAEの誘導は、CFAとの共通プロトコールによって誘発されたものよりも重篤な疾患をもたらした。この違いは、抗酸菌11の細胞壁における脂質成分の違いに起因す?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、日本学術振興会の助成を受けています(助成番号。特開23K14675)。

Materials

anti-mouse CD115 antibody Biolegend, USA 135505 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody Biolegend, USA 101215 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody Biolegend, USA 117313 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody Biolegend, USA 101302 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody Biolegend, USA 116004 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody Biolegend, USA 100753 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody Biolegend, USA 107635 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody Biolegend, USA 128023 for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment Thermo Fisher Scientific, USA BD 211886 for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice Charles River Laboratory, Japan 3 weeks old, male and female
FBS 10279-106 Gibco Life Techologies, USA 42F9155K for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine Eyela, Tokyo, Japan FDU-1200 for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant Difco Laboratories, MD, USA 263810 for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth Difco Laboratories, MD, USA 90003-876 help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 ATCC, USA BAA-968 bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated BD Biosciences, USA 743-26880-EA for use in adjuvant
Mycobactin J Allied Laboratory, MO, USA growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 AnaSpec, USA AS-60130-10 encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264) Sigma-Aldrich, USA S7951-1MG negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution Fujifilm Wako, Osaka Japan 168-22471 From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100 Kinematica for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine Gibco Life Techologies, USA 11875093 For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi PerkinElmer, Waltham, MA, USA NET027W001MC for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit Biolegend, USA 423105  cytofluorimetry, for cell viability

References

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Cite This Article
Cossu, D., Tomizawa, Y., Momotani, E., Yokoyama, K., Hattori, N. Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (195), e65422, doi:10.3791/65422 (2023).

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