النشاط المساعد للمتفطرة نظيرة السل في تعزيز مناعة المستضدات الذاتية أثناء التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا بديلا للحث بنشاط على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي في الفئران C57BL / 6 ، باستخدام البروتين السكري قليل التغصن قليل التغصن المناعي (MOG) 35-55 المعلق في مساعد فرويند غير المكتمل الذي يحتوي على المتفطرة الطيرية المقتولة بالحرارة paratuberculosis.
Abstract
يتطلب التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) الناجم عن البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) التحصين بواسطة ببتيد MOG المستحلب في مساعد فرويند الكامل (CFA) الذي يحتوي على المتفطرة السلية المعطلة. تعمل المكونات المستضدية للمتفطرة على تنشيط الخلايا المتغصنة لتحفيز الخلايا التائية لإنتاج السيتوكينات التي تعزز استجابة Th1 عبر مستقبلات تشبه الرسوم. لذلك ، ترتبط كمية وأنواع المتفطرات الموجودة خلال التحدي المستضد ارتباطا مباشرا بتطور EAE. تقدم ورقة الطرق هذه بروتوكولا بديلا للحث على EAE في الفئران C57BL / 6 باستخدام مساعد Freund غير مكتمل معدل يحتوي على سلالة المتفطرة الطيرية المقتولة بالحرارة سلالة السل K-10.
المتفطرة السلية، وهي عضو في مجمع المتفطرة الطيرية (Mycobacterium avium)، هي العامل المسبب لمرض جون في المجترات، وقد تم تحديدها كعامل خطر للعديد من الاضطرابات البشرية بوساطة الخلايا التائية، بما في ذلك التصلب المتعدد. وعموما، أظهرت الفئران المحصنة بالمتفطرة نظيرة السل بداية مبكرة وشدة مرض أكبر من الفئران المحصنة بداء السل الذي يحتوي على سلالة المتفطرة السلية H37Ra عند نفس الجرعات البالغة 4 ملغم/مل. تمكنت المحددات المستضدية لسلالة المتفطرة الطيرية (MAP) من سلالة K-10 من إحداث استجابة خلوية قوية Th1 خلال مرحلة المستجيب ، والتي تتميز بأعداد أكبر بكثير من الخلايا اللمفاوية التائية (CD4 + CD27 +) ، والخلايا المتغصنة (CD11c + I-A / I-E +) ، والوحيدات (CD11b + CD115 +) في الطحال مقارنة بالفئران المحصنة ب CFA. علاوة على ذلك ، يبدو أن استجابة الخلايا التائية التكاثرية لببتيد MOG هي الأعلى في الفئران المحصنة ضد السل. قد يكون استخدام الدماغ الليتفوت (على سبيل المثال ، MOG35-55) المستحلب في مادة مساعدة تحتوي على M. paratuberculosis في التركيبة طريقة بديلة ومثبتة لتنشيط الخلايا المتغصنة لتحضير الخلايا التائية CD4 + T الخاصة بالمايلين أثناء مرحلة تحريض EAE.
Introduction
التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج شائع لدراسة اضطرابات إزالة الميالين البشرية1. هناك عدة نماذج من EAE: التحصين النشط باستخدام ببتيدات المايلين المختلفة مع المواد المساعدة القوية ، والتحصين السلبي عن طريق النقل في المختبر للخلايا الليمفاوية CD4 + الخاصة بالمايلين ، والنماذج المعدلة وراثيا ل EAE2 التلقائي. يحتوي كل نموذج من هذه النماذج على ميزات محددة تسمح بدراسة جوانب مختلفة من EAE ، مثل مرحلة البداية أو المستجيب أو المرحلة المزمنة. يعد نموذج البروتين السكري قليل التغصن النخاعي (MOG) ل EAE نموذجا جيدا لدراسة الآليات المناعية للالتهاب العصبي المزمن وإزالة الميالين ، حيث يتميز بتسلل التهابي أحادي النواة ، وإزالة الميالين في المادة البيضاء المحيطية ، وتقليل الشفاء بعد ذروة المرض1.
يتم تحفيز MOG-EAE عن طريق تحصين الفئران الحساسة مع الببتيد MOG35-55 في مساعد فرويند الكامل (CFA) ، يليه حقن داخل الصفاق من سم السعال الديكي. هذا يزيد من نفاذية الحاجز الدموي الدماغي ويسمح للخلايا التائية الخاصة بالمايلين التي يتم تنشيطها في المحيط بالوصول إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، حيث سيتم إعادة تنشيطها3. يلعب CFA دورا رئيسيا في تحريض EAE من خلال تعزيز امتصاص المستضد بواسطة الخلايا المقدمة للمستضد والتعبير عن السيتوكينات المتعلقة بالاستجابات الخلطية والخلوية4. هذه الآلية ترجع أساسا إلى وجود المتفطرة السلية المقتولة المستحلبة في الزيت ، والتي توفر مكوناتها حافزا قويا لجهاز المناعة5. في الواقع ، يرتبط تحريض EAE ارتباطا مباشرا بكمية المتفطرة الموجودة خلال التحدي المستضد6.
إن إضافة المتفطرات المقتولة الأخرى ، مثل المتفطرة الزبدية ، إلى مساعدفرويند 7 غير المكتمل ، وكذلك تأثير المجموعات المساعدة8 ، يمكن أن يعدل المسار السريري ل EAE وبالتالي يؤثر على استنساخ النتائج. ارتبطت سلالات المتفطرة الطيرية نظير السل (MAP) ، العامل المسبب لمرض جون في المجترات ، بالاضطرابات الالتهابية في الجهاز العصبي المركزي البشري 9 ، حيث أن مكوناته المستضدية قادرة على إثارة استجابة قوية بوساطة الخلط والخلايا في المرضى الذين يعانون من التصلب المتعدد واضطراب طيف التهاب النخاع والعصبالبصري 9. لذلك ، في هذا البروتوكول ، نعرض طريقة بديلة وقابلة للتكرار للحث على MOG-EAE عن طريق استبدال M. السل في CFA ب M. paratuberculosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد أظهرنا بروتوكولا بديلا قويا للحث بنشاط على EAE الشديد في الفئران C57BL / 6J باستخدام الببتيد MOG35-55 المستحلب في مادة مساعدة تحتوي على M. paratuberculosis10. أدى تحريض EAE بهذه الطريقة إلى مرض أكثر حدة من ذلك الناجم عن البروتوكول المشترك مع CFA. يمكن أن يكون هذا الاختلاف بسبب المكونا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتلقى هذا العمل دعما من منحة من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (المنحة رقم. JP 23K14675).
Materials
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
- Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114 (2013).
- Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).
- Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
- O’Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
- Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).
- Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).
