Summary

פעילות אדג'ובנטית של Mycobacterium paratuberculosis בשיפור האימונוגניות של אוטואנטיגנים במהלך אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

Published: May 12, 2023
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חלופי לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית בעכברי C57BL/6, תוך שימוש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG)35-55 אפיטופ אימונוגני המושהה באדג’ובנט של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis שהומת בחום.

Abstract

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) הנגרמת על ידי גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) דורשת חיסון על ידי פפטיד MOG המתחלב באדג’ובנט מלא של פרוינד (CFA) המכיל Mycobacterium tuberculosis בלתי פעיל. המרכיבים האנטיגניים של המיקובקטריום מפעילים תאים דנדריטיים כדי לעורר תאי T לייצר ציטוקינים המקדמים את תגובת Th1 באמצעות קולטנים דמויי אגרה. לכן, כמות ומינים של מיקובקטריה נוכחים במהלך האתגר האנטיגני קשורים ישירות להתפתחות EAE. מאמר שיטות זה מציג פרוטוקול חלופי להשראת EAE בעכברי C57BL/6 באמצעות אדג’ובנט לא שלם של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis זן K-10 שהומת בחום.

M. paratuberculosis, חבר בקומפלקס Mycobacterium avium, הוא הגורם הסיבתי למחלת ג’ון במעלי גירה וזוהה כגורם סיכון למספר הפרעות בתיווך תאי T אנושיים, כולל טרשת נפוצה. באופן כללי, עכברים שחוסנו בחיידק Mycobacterium paratuberculosis הראו התפרצות מוקדמת יותר וחומרת מחלה גבוהה יותר מאשר עכברים שחוסנו ב-CFA המכיל את הזן של M. tuberculosis H37Ra באותם מינונים של 4 מ”ג/מ”ל. הדטרמיננטים האנטיגניים של תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) זן K-10 הצליחו לגרום לתגובה תאית חזקה של Th1 במהלך שלב האפקטורים, המאופיינת במספר גבוה משמעותית של לימפוציטים מסוג T (CD4+ CD27+), תאים דנדריטיים (CD11c+ I-A/I-E+) ומונוציטים (CD11b+ CD115+) בטחול בהשוואה לעכברים שחוסנו ב-CFA. יתר על כן, נראה כי תגובת תאי T למפפטיד MOG הייתה הגבוהה ביותר בעכברים שחוסנו נגד M. paratuberculosis. השימוש באנצפליטוגן (למשל, MOG35-55) המתחלב באדג’ובנט המכיל M. paratuberculosis בניסוח עשוי להיות שיטה חלופית ומתוקפת להפעלת תאים דנדריטיים לפרימינג של תאי T ספציפיים לאפיטופ מיאלין CD4+ במהלך שלב האינדוקציה של EAE.

Introduction

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל נפוץ לחקר הפרעות דה-מיאלינציה בבני אדם1. ישנם מספר מודלים של EAE: חיסון פעיל באמצעות פפטידים שונים של מיאלין בשילוב עם אדג’ובנטים חזקים, חיסון פסיבי על ידי העברה חוץ גופית של לימפוציטים ספציפיים CD4+ למיאלין, ומודלים טרנסגניים של EAE2 ספונטני. לכל אחד מהמודלים הללו יש תכונות ספציפיות המאפשרות ללמוד היבטים שונים של EAE, כגון שלב ההתפרצות, שלב האפקט או השלב הכרוני. מודל הגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים של המיאלין (MOG) של EAE הוא מודל טוב לחקר המנגנונים בתיווך מערכת החיסון של דלקת עצבית כרונית ודמיאלינציה, שכן הוא מאופיין בחדירה דלקתית חד-גרעינית, דמיאלינציה בחומר הלבן ההיקפי והתאוששות מופחתת לאחר שיא המחלה1.

MOG-EAE מושרה על ידי חיסון עכברים רגישים עם הפפטיד MOG35-55 באדג’ובנט מלא של פרוינד (CFA), ואחריו הזרקה תוך צפקית של רעלן שעלת. זה מגביר את החדירות של מחסום הדם-מוח ומאפשר לתאי T ספציפיים למיאלין המופעלים בפריפריה להגיע למערכת העצבים המרכזית (CNS), שם הם יופעלו מחדש3. CFA ממלא תפקיד מפתח בהשראת EAE על ידי שיפור ספיגת האנטיגן על ידי תאים מציגי אנטיגן וביטוי ציטוקינים הקשורים לתגובות הומור ותאיות4. מנגנון זה נובע בעיקר מנוכחות של Mycobacterium tuberculosis מומת בשמן, שמרכיביו מספקים גירוי חזק למערכת החיסונית5. למעשה, השראת EAE קשורה ישירות לכמות המיקובקטריום הקיימת במהלך האתגר האנטיגני6.

התוספת של מיקובקטריה מומתת אחרת, כגון Mycobacterium butyricum, לאדג’ובנט7 של פרוינד, כמו גם ההשפעה של שילובים אדג’ובנטיים8, יכולה לווסת את המהלך הקליני של EAE וכתוצאה מכך להשפיע על יכולת השחזור של התוצאות. תת-המין Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP), הסוכן האטיולוגי של מחלת ג’ון במעלי גירה, נקשר להפרעות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית 9 האנושית, שכן מרכיביו האנטיגניים מסוגלים לעורר תגובה הומוריסטית ותאית חזקה בחולים עם טרשת נפוצה והפרעת ספקטרום נוירומיאליטיס אופטיקה9. לכן, בפרוטוקול זה, אנו מראים שיטה חלופית וניתנת לשחזור להשראת MOG-EAE על ידי החלפת M. tuberculosis ב- CFA ב- M. paratuberculosis.

Protocol

כל הניסויים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת חונטנדו (אישור מספר 290238) ונערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לניסויים בבעלי חיים. 1. הערות כלליות על הניסוי אחסן את העכברים בכלובים נפרדים במת?…

Representative Results

קבוצות של עכברי C57BL/6 (סה”כ n = 15/קבוצה) חוסנו ב-MOG35-55 בתחליב המכיל M. paratuberculosis או בשיטה הנפוצה עם CFA. כל קבוצות העכברים הפגינו מחלה מונופאזית חריפה המאופיינת בשיא נכות יחיד שנצפה לאחר 14-17 ימים, ואחריו החלמה חלקית של הסימפטומים במהלך 10 הימים הבאים (איור 1A</str…

Discussion

הדגמנו פרוטוקול חלופי חזק לגרימת EAE חמור באופן פעיל בעכברי C57BL/6J באמצעות הפפטיד MOG35-55 המתחלב באדג’ובנט המכיל M. paratuberculosis10. השראת EAE בשיטה זו הביאה למחלה חמורה יותר מזו שנגרמה על ידי הפרוטוקול המשותף עם CFA. הבדל זה יכול לנבוע מהמרכיבים השומניים השונים בדופן התא של המיקו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו קיבלה תמיכה ממענק מהאגודה היפנית לקידום המדע (מענק מס. JP 23K14675).

Materials

anti-mouse CD115 antibody Biolegend, USA 135505 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody Biolegend, USA 101215 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody Biolegend, USA 117313 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody Biolegend, USA 101302 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody Biolegend, USA 116004 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody Biolegend, USA 100753 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody Biolegend, USA 107635 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody Biolegend, USA 128023 for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment Thermo Fisher Scientific, USA BD 211886 for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice Charles River Laboratory, Japan 3 weeks old, male and female
FBS 10279-106 Gibco Life Techologies, USA 42F9155K for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine Eyela, Tokyo, Japan FDU-1200 for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant Difco Laboratories, MD, USA 263810 for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth Difco Laboratories, MD, USA 90003-876 help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 ATCC, USA BAA-968 bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated BD Biosciences, USA 743-26880-EA for use in adjuvant
Mycobactin J Allied Laboratory, MO, USA growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 AnaSpec, USA AS-60130-10 encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264) Sigma-Aldrich, USA S7951-1MG negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution Fujifilm Wako, Osaka Japan 168-22471 From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100 Kinematica for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine Gibco Life Techologies, USA 11875093 For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi PerkinElmer, Waltham, MA, USA NET027W001MC for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit Biolegend, USA 423105  cytofluorimetry, for cell viability

References

  1. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
  2. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  3. Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
  4. Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114 (2013).
  5. Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).
  6. Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
  7. O’Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
  8. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
  9. Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).
  10. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
  11. Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
  12. Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).
  13. Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).
  14. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).

Play Video

Cite This Article
Cossu, D., Tomizawa, Y., Momotani, E., Yokoyama, K., Hattori, N. Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (195), e65422, doi:10.3791/65422 (2023).

View Video