Summary

Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Published: May 12, 2023
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Summary

Aquí, presentamos un protocolo alternativo para inducir activamente encefalomielitis autoinmune experimental en ratones C57BL / 6, utilizando la glicoproteína oligodendrocitos de mielina inmunogénica epítopo (MOG) 35-55 suspendida en el adyuvante de Freund incompleto que contiene la subespecie paratuberculosis Mycobacterium avium muerta por calor.

Abstract

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida por la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) requiere la inmunización por un péptido MOG emulsionado en el adyuvante de Freund completo (CFA) que contiene Mycobacterium tuberculosis inactivada. Los componentes antigénicos de la micobacteria activan las células dendríticas para estimular a las células T a producir citoquinas que promueven la respuesta Th1 a través de receptores tipo toll. Por lo tanto, la cantidad y las especies de micobacterias presentes durante el desafío antigénico están directamente relacionadas con el desarrollo de EAE. Este documento de métodos presenta un protocolo alternativo para inducir EAE en ratones C57BL / 6 utilizando un adyuvante de Freund incompleto modificado que contiene la subespecie de paratuberculosis K-10 de Mycobacterium avium muerta por calor.

M. paratuberculosis, un miembro del complejo Mycobacterium avium, es el agente causal de la enfermedad de Johne en rumiantes y se ha identificado como un factor de riesgo para varios trastornos mediados por células T humanas, incluida la esclerosis múltiple. En general, los ratones inmunizados con Mycobacterium paratuberculosis mostraron un inicio más temprano y una mayor gravedad de la enfermedad que los ratones inmunizados con CFA que contenían la cepa de M. tuberculosis H37Ra a las mismas dosis de 4 mg / ml. Los determinantes antigénicos de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) cepa K-10 fueron capaces de inducir una fuerte respuesta celular Th1 durante la fase efectora, caracterizada por un número significativamente mayor de linfocitos T (CD4+ CD27+), células dendríticas (CD11c+ I-A/I-E+) y monocitos (CD11b+ CD115+) en el bazo en comparación con los ratones inmunizados con CFA. Además, la respuesta proliferativa de las células T al péptido MOG pareció ser más alta en ratones inmunizados con M. paratuberculosis. El uso de un encefalitógeno (por ejemplo, MOG35-55) emulsionado en un adyuvante que contiene M. paratuberculosis en la formulación puede ser un método alternativo y validado para activar las células dendríticas para preparar las células T CD4+ específicas del epítopo de mielina durante la fase de inducción de la EAE.

Introduction

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo común para el estudio de los trastornos desmielinizantes humanos1. Existen varios modelos de EAE: inmunización activa utilizando diferentes péptidos de mielina en combinación con potentes adyuvantes, inmunización pasiva mediante transferencia in vitro de linfocitos CD4+ específicos de mielina y modelos transgénicos de EAE2 espontánea. Cada uno de estos modelos tiene características específicas que permiten estudiar diferentes aspectos de EAE, como el inicio, la fase efectora o la fase crónica. El modelo de glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) de EAE es un buen modelo para estudiar los mecanismos inmunomediados de la neuroinflamación crónica y la desmielinización, ya que se caracteriza por la infiltración inflamatoria mononuclear, la desmielinización en la sustancia blanca periférica y la reducción de la recuperación después del pico de la enfermedad1.

MOG-EAE es inducida por inmunización de ratones susceptibles con el péptido MOG35-55 en adyuvante de Freund completo (CFA), seguido de una inyección intraperitoneal de toxina pertussis. Esto aumenta la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y permite que las células T específicas de mielina activadas en la periferia lleguen al sistema nervioso central (SNC), donde serán reactivadas3. La CFA juega un papel clave en la inducción de EAE al mejorar la captación de antígenos por las células presentadoras de antígenos y la expresión de citoquinas relacionadas con las respuestas humorales y mediadas por células4. Este mecanismo se debe principalmente a la presencia de Mycobacterium tuberculosis muerta emulsionada en aceite, cuyos componentes proporcionan un fuerte estímulo para el sistema inmune5. De hecho, la inducción de EAE está directamente relacionada con la cantidad de micobacterias presentes durante el desafío antigénico6.

La adición de otras micobacterias muertas, como Mycobacterium butyricum, al adyuvante incompleto de Freund 7, así como el efecto de combinaciones adyuvantes8, pueden modular el curso clínico de la EAE y, en consecuencia, influir en la reproducibilidadde los resultados. Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP), el agente etiológico de la enfermedad de Johne en rumiantes, se ha asociado con trastornos inflamatorios del SNChumano 9, ya que sus componentes antigénicos son capaces de provocar una fuerte respuesta humoral y mediada por células en pacientes con esclerosis múltiple y trastorno del espectro de neuromielitis óptica9. Por lo tanto, en este protocolo, mostramos un método alternativo y reproducible para inducir MOG-EAE mediante la sustitución de M. tuberculosis en CFA por M. paratuberculosis.

Protocol

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Juntendo (Número de Aprobación 290238) y se llevaron a cabo de acuerdo con las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para la Experimentación Animal. 1. Observaciones generales sobre el experimento Alojar a los ratones en jaulas individuales en la instalación animal en condiciones controladas y libres …

Representative Results

Grupos de ratones C57BL/6 (total n = 15/grupo) fueron inmunizados con MOG35-55 en una emulsión que contenía M. paratuberculosis o por el método común con CFA. Todos los grupos de ratones manifestaron una enfermedad monofásica aguda caracterizada por un único pico de discapacidad observado a los 14-17 días, seguido de una recuperación parcial de los síntomas durante los siguientes 10 días (Figura 1A). Los ratones inmunizados con e…

Discussion

Demostramos un protocolo alternativo robusto para inducir activamente EAE severa en ratones C57BL / 6J utilizando el péptido MOG35-55 emulsionado en un adyuvante que contiene M. paratuberculosis10. La inducción de EAE por este método resultó en una enfermedad más grave que la inducida por el protocolo común con CFA. Esta diferencia podría deberse a los diferentes componentes lipídicos en la pared celular de las micobacterias11. De hecho, a difere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo recibió apoyo de una subvención de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (subvención no. JP 23K14675).

Materials

anti-mouse CD115 antibody Biolegend, USA 135505 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody Biolegend, USA 101215 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody Biolegend, USA 117313 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody Biolegend, USA 101302 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody Biolegend, USA 116004 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody Biolegend, USA 100753 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody Biolegend, USA 107635 for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody Biolegend, USA 128023 for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment Thermo Fisher Scientific, USA BD 211886 for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice Charles River Laboratory, Japan 3 weeks old, male and female
FBS 10279-106 Gibco Life Techologies, USA 42F9155K for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine Eyela, Tokyo, Japan FDU-1200 for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant Difco Laboratories, MD, USA 263810 for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth Difco Laboratories, MD, USA 90003-876 help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 ATCC, USA BAA-968 bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated BD Biosciences, USA 743-26880-EA for use in adjuvant
Mycobactin J Allied Laboratory, MO, USA growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 AnaSpec, USA AS-60130-10 encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264) Sigma-Aldrich, USA S7951-1MG negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution Fujifilm Wako, Osaka Japan 168-22471 From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100 Kinematica for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine Gibco Life Techologies, USA 11875093 For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi PerkinElmer, Waltham, MA, USA NET027W001MC for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit Biolegend, USA 423105  cytofluorimetry, for cell viability

References

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Cite This Article
Cossu, D., Tomizawa, Y., Momotani, E., Yokoyama, K., Hattori, N. Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (195), e65422, doi:10.3791/65422 (2023).

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