Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial
Summary
Los sitios de contacto mitocondrial son complejos proteicos que interactúan con las proteínas de la membrana interna y externa mitocondrial. Estos sitios son esenciales para la comunicación entre las membranas mitocondriales y, por lo tanto, entre el citosol y la matriz mitocondrial. Aquí, describimos un método para identificar candidatos que califican para esta clase específica de proteínas.
Abstract
Las mitocondrias están presentes en prácticamente todas las células eucariotas y realizan funciones esenciales que van mucho más allá de la producción de energía, por ejemplo, la síntesis de grupos de hierro-azufre, lípidos o proteínas, la amortiguación de Ca2+ y la inducción de la apoptosis. Del mismo modo, la disfunción mitocondrial da lugar a enfermedades humanas graves como el cáncer, la diabetes y la neurodegeneración. Para realizar estas funciones, las mitocondrias tienen que comunicarse con el resto de la célula a través de su envoltura, que consta de dos membranas. Por lo tanto, estas dos membranas tienen que interactuar constantemente. Los sitios de contacto proteico entre las membranas interna y externa mitocondrial son esenciales a este respecto. Hasta el momento, se han identificado varios sitios de contacto. En el método descrito aquí, las mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae se utilizan para aislar los sitios de contacto y, por lo tanto, identificar candidatos que califican para proteínas del sitio de contacto. Utilizamos este método para identificar el complejo del sitio de contacto mitocondrial y el sistema organizador de crestas (MICOS), uno de los principales complejos formadores de sitios de contacto en la membrana interna mitocondrial, que se conserva de la levadura a los humanos. Recientemente, mejoramos aún más este método para identificar un nuevo sitio de contacto que consiste en Cqd1 y el complejo Por1-Om14.
Introduction
Las mitocondrias realizan una variedad de funciones diferentes en los eucariotas, siendo la más conocida la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa. Otras funciones incluyen la producción de grupos de hierro-azufre, la síntesis de lípidos y, en eucariotas superiores, la señalización de Ca2+ y la inducción de la apoptosis 1,2,3,4. Estas funciones están inseparablemente ligadas a su compleja ultraestructura.
La ultraestructura mitocondrial fue descrita por primera vez por microscopía electrónica5. Se demostró que las mitocondrias son orgánulos bastante complejos que constan de dos membranas: la membrana externa mitocondrial y la membrana interna mitocondrial. Así, estas membranas forman dos compartimentos acuosos: el espacio intermembrana y la matriz. La membrana interna mitocondrial se puede dividir aún más en diferentes secciones. La membrana límite interna permanece muy cerca de la membrana externa, y las crestas forman invaginaciones. Las llamadas uniones crista conectan la membrana límite interna y las crestas (Figura 1). Además, las micrografías electrónicas de mitocondrias osmóticamente encogidas revelan que existen sitios en los que las membranas mitocondriales están estrechamente conectadas 6,7. Estos llamados sitios de contacto están formados por complejos proteicos que abarcan las dos membranas (Figura 1). Se cree que estos sitios de interacción son esenciales para la viabilidad celular debido a su importancia para la regulación de la dinámica mitocondrial y la herencia, así como para la transferencia de metabolitos y señales entre el citosol y la matriz8.
El complejo MICOS en la membrana interna mitocondrial es probablemente el complejo formador de sitios de contacto mejor caracterizado y más versátil. MICOS fue descrito en levaduras en 2011, y consta de seis subunidades 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 y Mic10. Estos forman un complejo de aproximadamente 1,5 MDa que se localiza en las unionescrista 9,10,11. La deleción de cualquiera de las subunidades centrales, Mic10 o Mic60, conduce a la ausencia de este complejo 9,11, lo que significa que estas dos subunidades son esenciales para la estabilidad de MICOS. Curiosamente, MICOS forma no solo uno, sino múltiples sitios de contacto con varias proteínas y complejos de la membrana externa mitocondrial: el complejo TOM 11,12, el complejo TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, el complejo Fzo1-Ugo19,Por1 10, OM45 10 y Miro 17. Esto indica fuertemente que el complejo MICOS está involucrado en varios procesos mitocondriales, como la importación de proteínas, el metabolismo de los fosfolípidos y la generación de la ultraestructura mitocondrial18. Esta última función es probablemente la principal función de MICOS, ya que la ausencia del complejo MICOS inducida a través de la deleción de MIC10 o MIC60 conduce a una ultraestructura mitocondrial anormal que carece prácticamente por completo de crestas regulares. En cambio, las vesículas de membrana interna sin conexión con la membrana límite interna acumulan19, 20. Es importante destacar que MICOS se conserva en forma y función desde la levadura hasta el ser humano21. La asociación de mutaciones en subunidades MICOS con enfermedades humanas graves también enfatiza su importancia para los eucariotas superiores22,23. Aunque MICOS es muy versátil, deben existir sitios de contacto adicionales (según nuestras observaciones no publicadas). De hecho, se han identificado varios otros sitios de contacto, por ejemplo, las maquinarias de fusión mitocondrial Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 o Mdm31-Por1, que está involucrada en la biosíntesis del fosfolípido mitocondrial específico cardiolipina 27. Recientemente, mejoramos el método que nos llevó a la identificación de MICOS para identificar Cqd1 como parte de un nuevo sitio de contacto formado con el complejo de membrana externa Por1-Om1428. Curiosamente, este sitio de contacto también parece estar involucrado en múltiples procesos, como la homeostasis de la membrana mitocondrial, el metabolismo de los fosfolípidos y la distribución de la coenzima Q28,29.
En este caso, se utilizó una variación del fraccionamiento de mitocondrias descrito anteriormente 9,30,31,32,33. El tratamiento osmótico de las mitocondrias conduce a la ruptura de la membrana externa mitocondrial y a una contracción del espacio de la matriz, dejando las dos membranas solo muy cerca en los sitios de contacto. Esto permite la generación de vesículas que consisten exclusivamente en la membrana externa mitocondrial o en la membrana interna mitocondrial o en los sitios de contacto de ambas membranas a través de una sonicación suave. Debido a que la membrana interna mitocondrial posee una proporción proteína-lípidos mucho más alta, las vesículas de la membrana interna mitocondrial exhiben una mayor densidad en comparación con las vesículas de la membrana externa mitocondrial. La diferencia de densidad se puede utilizar para separar las vesículas de membrana a través de la centrifugación en gradiente de densidad de flotación de sacarosa. Por lo tanto, las vesículas de la membrana externa mitocondrial se acumulan a bajas concentraciones de sacarosa, mientras que las vesículas de la membrana interna mitocondrial se enriquecen a altas concentraciones de sacarosa. Las vesículas que contienen los sitios de contacto se concentran en concentraciones intermedias de sacarosa (Figura 2). El siguiente protocolo describe en detalle este método mejorado, que requiere menos equipo especializado, tiempo y energía en comparación con el establecido anteriormente32, y proporciona una herramienta útil para la identificación de posibles proteínas en el sitio de contacto.
Protocol
Representative Results
Discussion
El subfraccionamiento mitocondrial es un experimento complicado con varios pasos muy complejos. Por lo tanto, nuestro objetivo era mejorar aún más y, hasta cierto punto, simplificar nuestro método establecido32. En este caso, los desafíos eran la necesidad de equipos complicados y altamente especializados, que a menudo son construcciones individuales, y el enorme consumo de tiempo y energía. Con este fin, intentamos eliminar las bombas y las construcciones individuales utilizadas para la fund…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.E.H. agradece a la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), proyecto número 413985647, por su apoyo financiero. Los autores agradecen al Dr. Michael Kiebler, de la Universidad Ludwig-Maximilians, Múnich, por su generoso y amplio apoyo. Agradecemos a Walter Neupert por su aporte científico, sus útiles discusiones y su continua inspiración. J.F. agradece a la Escuela de Graduados de Ciencias de la Vida de Múnich (LSM) por su apoyo.
Materials
| 13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
| 50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
| A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
| Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any pipet controller will suffice |
|
| accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
| Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
| Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
| Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
| Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
| Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
| Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
| cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
| D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
| EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
| Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
| graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
| graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
| ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
| Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
| MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
| MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
| MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
| STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8×120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
| stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
| Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
| Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
| TRIS | Roth, Germany | 4855 |
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