Платформа визуализации «The Lifespan Machine» автоматизирует пожизненное наблюдение за большими популяциями. Мы показываем шаги, необходимые для проведения анализов продолжительности жизни, стрессоустойчивости, патогенеза и поведенческого старения. Качество и объем данных позволяют исследователям изучать вмешательства в старение, несмотря на наличие биологических и экологических вариаций.
Генетически идентичные животные, содержащиеся в постоянной окружающей среде, демонстрируют широкое распределение продолжительности жизни, что отражает большой негенетический, стохастический аспект старения, сохраняющийся у всех изученных организмов. Этот стохастический компонент означает, что для того, чтобы понять старение и определить успешные вмешательства, которые продлевают продолжительность жизни или улучшают здоровье, исследователи должны одновременно наблюдать за большими популяциями экспериментальных животных. Традиционная ручная оценка смертности ограничивает пропускную способность и масштаб, необходимые для крупномасштабной проверки гипотез, что приводит к разработке автоматизированных методов для высокопроизводительных анализов продолжительности жизни. Lifespan Machine (LSM) — это высокопроизводительная платформа визуализации, которая сочетает в себе модифицированные планшетные сканеры с настраиваемым программным обеспечением для обработки изображений и проверки данных для отслеживания нематод в течение всего срока службы. Платформа представляет собой крупный технический прогресс, генерируя данные о продолжительности жизни больших популяций животных с высоким временным разрешением в беспрецедентном масштабе и со статистической точностью и точностью, равными ручным анализам, выполняемым опытными исследователями. В последнее время LSM был усовершенствован для количественной оценки поведенческих и морфологических изменений, наблюдаемых во время старения, и соотнесения их с продолжительностью жизни. В этой статье мы опишем, как спланировать, запустить и проанализировать автоматизированный эксперимент по увеличению продолжительности жизни с помощью LSM. Далее мы выделяем важнейшие шаги, необходимые для успешного сбора поведенческих данных и высококачественных кривых выживаемости.
Старение – это сложный, многогранный процесс, характеризующийся снижением физиологической функции организма, что приводит к увеличению риска заболеваний и смерти стечением времени1. Продолжительность жизни, измеряемая как время от рождения или начала взрослой жизни до смерти, дает однозначный результат старения2 и косвенный, но строго количественный показатель для измерения относительной скорости старения между популяциями3. Исследования старения часто зависят от точных измерений продолжительности жизни, аналогичных клиническим испытаниям, для сравнения исходов между одной популяцией, подвергшейся вмешательству, и контрольной группой, не подвергшейся воздействию. К сожалению, проблемы воспроизводимости пронизывают все исследования старения, иногда из-за статистически недостаточно мощных экспериментов, а часто из-за присущей анализам продолжительности жизни чувствительности к тонким изменениямв окружающей среде. Робастные эксперименты требуют многократного повторения больших популяций, и этот процесс особенно выигрывает от экспериментальной масштабируемости, предлагаемой автоматизацией6.
Строгие требования к анализу продолжительности жизни проистекают из непредсказуемости самого процесса старения. Изогенные индивидуумы, содержащиеся в одинаковых условиях, демонстрируют разное время смерти и скорость физиологического упадка7, что позволяет предположить, что продолжительность жизни включает в себя высокую степень стохастичности 7,8. Таким образом, большие популяции должны измерять количественные изменения в процессе старения, такие как изменения средней или максимальной продолжительности жизни, и преодолевать систематические ошибки, возникающие из-за индивидуальной изменчивости. Кроме того, возможность проведения высокопроизводительных анализов продолжительности жизни имеет решающее значение для поддержки исследований форм кривых выживания и моделей динамики старения9.
Нематода Caenorhabditis elegans является бесценной моделью для исследований старения из-за ее короткой продолжительности жизни, генетической трактовки и быстрого времени генерации, что подчеркивает ее пригодность для высокопроизводительных анализов старения и продолжительности жизни. Традиционно продолжительность жизни в С. elegans измеряется путем наблюдения за синхронизированной небольшой популяцией из 50-100 животных в течение длительного времени на твердых носителях и записи времени смерти отдельных особей. По мере того, как животные стареют и теряют подвижность, ручная оценка времени смерти требует индивидуального подталкивания животных и проверки незначительных движений головы или хвоста. Обычно это утомительный и трудоемкий процесс, хотя были предприняты усилия, чтобы ускорить его 10,11,12. Важно отметить, что медленные экспериментальные конвейеры препятствуют прогрессу в нашем понимании старения и эффективности проверенных вмешательств.
Чтобы удовлетворить потребности в исследованиях старения для получения количественных данных, было разработано множество технологий для автоматизации сбора данных, в том числе замечательный спектр подходов от микрофлюидных камер до планшетных сканеров13, 14, 15, 16, 17, 18. LSM отличается от других методов своей обширной оптимизацией для сбора высокоточных и точных данных о сроке службы, что достигается за счет разработки тщательных протоколов калибровки оборудования в сочетании с обширным пакетом программного обеспечения, позволяющим пользователям проверять, корректировать и уточнять автоматизированные анализы13. Несмотря на то, что программное обеспечение в принципе может быть применено к различным методам визуализации, на практике большинство пользователей используют планшетные сканеры, модифицированные для обеспечения точного контроля над температурой и влажностью окружающей среды – факторами, имеющими решающее значение из-за их значительного влияния на срокслужбы. LSM делает снимки нематод каждые 20 минут с интервалом от нескольких дней до нескольких месяцев, в зависимости от условий окружающей среды и генотипа. Полученные данные имеют гораздо более высокое временное разрешение по сравнению с данными, полученными при ручном анализе, а собранные изображения обеспечивают постоянную визуальную запись положения нематоды на протяжении всей жизни. Используя методы машинного обучения, каждому человеку автоматически присваивается время смерти. Эти результаты могут быть быстро проверены вручную с помощью клиентского программного обеспечения под названием “Worm Browser”. Благодаря своему аппаратному и программному обеспечению, LSM может генерировать кривые выживаемости, которые статистически неотличимы от ручной оценки смертности, проводимой опытными исследователями, с дополнительным преимуществом в виде снижения рабочей нагрузки и более высокой масштабируемости13.
Последняя версия LSM также позволяет изучать поведенческое старение, собирая морфологические и поведенческие данные на протяжении всей жизни нематоды и сообщая о них вместе с продолжительностью жизни каждой особи. В частности, LSM фиксирует время прекращения энергичных движений (VMC) каждого животного, что часто используется для количественной оценки «продолжительности здоровья» индивидуума в отличие от продолжительности его жизни. Одновременно собирая данные о продолжительности жизни и поведенческом старении, LSM поддерживает изучение вмешательств, которые могут оказывать дифференцированное влияние на различные фенотипические исходы старения20 лет. Для изучения поведенческого старения могут быть использованы различные макроскопически наблюдаемые фенотипы, такие как движение тела или перекачивание фарингеза21, целостность тканей22 и скорость движения или поворот, вызванный стимулом17. Сравнение различных фенотипов старения может помочь в анализе причинно-следственной структуры процессов старения. Например, сравнение между VMC и продолжительностью жизни было недавно использовано для характеристики двух различных процессов старения у C. elegans23.
Несмотря на то, что первоначально LSM был разработан для измерения продолжительности жизни у C. elegans, он поддерживает сбор данных о выживаемости и поведении ряда видов нематод, включая C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. Бреннери и . Пасификус23. Технология облегчает изучение влияния биологических и экологических вмешательств на продолжительность жизни, стрессоустойчивость и устойчивость к патогенам и может быть связана с экспериментальными инструментами, такими как таргетные анализы РНК-интерференции или ауксин-индуцируемые системы деградации белков. На сегодняшний день он используется в научной литературе для широкого спектра применений 6,24,25,26,27,28,29,30.
В этой статье мы опишем пошаговый протокол выполнения эксперимента Lifespan Machine с использованием агаровых пластин, начиная с начальных этапов экспериментальной установки и заканчивая получением результирующих кривых выживаемости. Отличительной чертой LSM является то, что работа выполняется на начальном этапе, а это означает, что большая часть времени исследователя тратится на экспериментальную установку и, в небольшой степени, на получение изображений после нее. Сбор данных полностью автоматизирован на протяжении всего эксперимента и позволяет исследователю работать без помощи рук. Шаги, описанные здесь, являются общими для многих различных типов тестов на выживание – одна и та же экспериментальная установка выполняется для анализов продолжительности жизни, термотолерантности, окислительного стресса и патогенеза. В разделе «Репрезентативные результаты» мы обсуждаем подмножество данных из недавно опубликованной рукописи, чтобы проиллюстрировать эффективность конвейера анализа и выделить наиболее важные этапы анализа изображений23.
Здесь мы предоставляем подробный, доступный протокол для выполнения эксперимента с использованием последней версии Lifespan Machine. Мы показали, что критическим шагом для получения хорошо разрешенных кривых выживаемости является ручное исключение объектов, не являющихся червями, во время ?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Джулиана Серона (Julian Ceron) и Джереми Висенсио (Jeremy Vicencio) (IDIBELL Barcelona) за получение аллеля rpb-2 (cer135). Этот проект был профинансирован Европейским исследовательским советом (ERC) в рамках программы исследований и инноваций Европейского союза «Горизонт 2020» (Соглашение о гранте No 852201), Министерством экономики, промышленности и конкурентоспособности Испании (MEIC) в партнерстве с EMBL, Centro de Excelencia Severo Ochoa (CEX2020-001049-S, MCIN/AEI /10.13039/501100011033), Программой CERCA / Женералитат Каталонии, премией MEIC Excelencia BFU2017-88615-P, и премия Фонда Гленна по медицинским исследованиям.
1-Naphtaleneacetic acid (Auxin) | Sigma | N0640 | Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar |
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | 27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria |
Glass cleaner | Kristal-M | QB-KRISTAL-M125ml | |
Hydrophobic anti-fog glass treatment | Rain-X Scheibenreiniger | C. 059140 | |
Rubber matt | Local crafstman | Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock | |
Scanner glass | Local hardware supplier | 9" x 11.5" inch glass sheet | |
Scanner plates | Life Sciences | 351006 | 50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish |
USB Reference Thermometer | USB Brando | ULIFE055500 | For calibrating temperature of scanners |