Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לעבודה עם Limosilactobacillus reuteri DSM20016, המפרטים צמיחה, טרנספורמציה פלסמיד, PCR מושבה, מדידת חלבון מדווח פלואורסצנטי, ומיני הכנת פלסמיד מוגבלת, כמו גם בעיות נפוצות ופתרון בעיות. פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של חלבוני כתב DSM20016, או אישור באמצעות PCR מושבה אם אין מדווח מעורב.
Abstract
לקטובצילוס היה סוג גדול ומגוון להפליא של חיידקים שכלל 261 מינים, כמה מהם זנים קומנסליים עם פוטנציאל לשימוש כמארז למאמצים ביולוגיים סינתטיים במערכת העיכול. השונות הפנוטיפית והגנוטיפית הרחבה שנצפתה בתוך הסוג הובילה לאחרונה לסיווג מחדש ולהכנסת 23 סוגים חדשים.
בשל רוחב הווריאציות בתוך הז'אנר הישן, פרוטוקולים שהודגמו בחבר אחד עשויים שלא לעבוד כפי שפורסם עם חברים אחרים. מחסור במידע מרוכז על איך בדיוק לתפעל זנים ספציפיים הוביל למגוון גישות אד-הוק , שלעתים קרובות מותאמות ממשפחות חיידקים אחרות. זה יכול לסבך את העניינים עבור חוקרים מתחילים בתחום, שאולי לא יודעים איזה מידע חל או לא חל על הזן הנבחר שלהם.
במאמר זה, אנו שואפים לרכז סדרה של פרוטוקולים עם הצלחה מוכחת, במיוחד בכינוי זן Limosilactobacillus reuteri F275 (מספרי איסוף אחרים: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), יחד עם ייעוץ לפתרון בעיות ובעיות נפוצות שאדם עשוי להיתקל בהן. פרוטוקולים אלה אמורים לאפשר לחוקר עם ניסיון מועט, אם בכלל, בעבודה עם L. reuteri DSM20016 לשנות פלסמיד, לאשר טרנספורמציה ולמדוד משוב מערכת בקורא צלחות באמצעות חלבון כתב.
Introduction
הסוג לקטובצילוס סווג היסטורית כגראם-חיובי, בצורת מוט, שאינו יוצר נבגים, אנארובים פקולטטיביים או מיקרו-אירופילים המפרקים סוכרים לייצור חומצה לקטית1. קריטריונים רופפים אלה הובילו לכך שלקטובצילוס היה, מבחינה פנוטיפית וגנוטיפית, סוג מגוון ביותר. סיווג רחב זה הביא לסיווג מחדש של הסוג, והציג 23 סוגים חדשים בשנת 20202.
הסוג הוותיק והרחב יותר כלל זנים עיקריים של קומנסל ופרוביוטיקה הנחשבים בדרך כלל בטוחים לצריכה (GRAS)3. משפחת Lactobacillaceae שומרת על תפיסה ציבורית של היותם "חיידקים טובים" בשל היתרונות הבריאותיים המדווחים הרבים המוענקים באמצעות צריכת זנים שונים 4,5,6,7. הקלות שבה הם יכולים לנווט במערכת העיכול8 וקבלתם הציבורית משתלבים יחד כדי למצב את זני Lactobacillaceae כמועמדים חזקים כמו אורגניזמים שלדה ליישומים רפואיים, טיפוליים או אבחוניים הניתנים לבליעה.
המגוון הרחב של המאפיינים הקיימים במשפחת Lactobacillaceae הוביל למצב שבו אין זן מודל אורגניזם דה פקטו; קבוצות מחקר נטו לבחור מינים בעלי התכונות הרלוונטיות ביותר למטרותיהם הספציפיות. (לדוגמה, מעבדות תסיסה של מוצרי חלב יכולות לבחור ב-L. lactis; מחקרים על תסיסה צמחית עשויים לבחור ב-L. plantarum; מחקר על פרוביוטיקה עשוי להתמקד ב-L. acidophilus; וכן הלאה.)
אותו מגוון רחב של מאפיינים בין מינים שונים הוביל להצטברות של פרוטוקולים ופרוצדורות שעשויים לעבוד היטב עבור תת-קבוצה אחת של משפחת Lactobacillaceae , אך דורשים אופטימיזציה כדי לעבוד ביעילות (או אולי לתפקד בכלל) באחרים9. הצורך הזה באופטימיזציה בין בני משפחה ואפילו בתוך בני אותו מין יכול לסכל את מאמציהם של חוקרים לא מוכרים. פרוטוקולים המתפרסמים במדורי השיטות של מאמרים יכולים לכלול גם שינויים משלהם10, מה שמוביל לאוספי פרוטוקולים מקוטעים ומבוזרים.
L. reuteri נחשב לקומנסל נפוץ של בעלי חוליות, ונמצא באופן עקבי ביונקים, עופות11 ודגים12 במערכת העיכול (GI). תת-זנים של L. reuteri מתמחים לעתים קרובות גנטית, באמצעות הסתגלות חלבון הידבקות ריר, כדי ליישב באופן קבוע יותר פונדקאים מקומיים ספציפיים 8,11,13. מיני Limosilactobacillus במערכת העיכול יכולים להיות מבודדים בפונדקאים מחוץ לפונדקאי המקומי שלהם, אך נוטים יותר לטבע חולף8.
בשל התמחות האדם-מארח, L. reuteri DSM20016 ממצב את עצמו היטב כמארז ליישומים אבחוניים או טיפוליים בכל נקודה במערכת העיכול האנושית, והמאמץ DSM20016 יכול לספק חלון השפעה ארוך טווח יותר להתערבויות בהשוואה לזנים חולפים יותר.
במאמר זה, אנו מתארים סדרה של פרוטוקולים עם יעילות מוכחת ב- Limosilactobacillus reuteri (ייעוד זן: F275; מספרי איסוף אחרים: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), יחד עם מידע מרוכז על הזן ממקורות אחרים כדי לסייע ביישומים ביולוגיים מולקולריים ומערכתיים. הנהלים המפורטים כאן צריכים לאפשר לחוקר ללא ניסיון קודם לתרבית L. reuteri, ליצור מלאי אלקטרוכשיר, לבחור מושבות מותמרות, לאשר טרנספורמציה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז מושבה (PCR), ולמדוד תגובת מערכת מתוכננת באמצעות חלבוני כתב פלואורסצנטי.
נציין כי פרוטוקולים קשורים כיסו רקומבינציה מחדש של גנום SSDNA בסיוע CRISPR-Cas9 ב- L. reuteri (זן: ATCC-PTA-6475)14, ועריכת גנום בסיוע CRSIPR-Cas9 nickase במספר רב שאינו L. ראוטרי, Lactobacillaceae משפחה כתמים15,16; עם זאת, אלה אינם מתייחסים לזן L. reuteri DSM20016 שבו אנו מתמקדים כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת L. reuteri DSM20016 תאים אלקטרוכשירים
הערה: פרוטוקול זה מבוסס על פרוטוקול של Berthier et al.17, עם מהירויות צנטריפוגה שהודיעו על ידי Rattanachaikunsopon et al.18.
- בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, יש לחסן את L. reuteri ממלאי גליצרול ל-6 מ"ל של מרק deMan Rogosa Sharpe (MRS). יש לדגור באופן אירובי למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור סטטי.
- למחרת בבוקר, לחסן 4 מ"ל של תרבית לילה לתוך 200 מ"ל של מרק MRS (דילול 1:50).
- אפשר לגדול באופן אירובי באינקובטור סטטי של 37 מעלות צלזיוס עד שערך הצפיפות האופטית של 600 ננומטר (OD600) יגיע ל 0.5-0.85; זה אמור לקחת בערך 2-3 שעות.
- ברגע שמגיעים לערך OD600 הולם, מרוקנים את המדיה לצינורות צנטריפוגות של 50 מ"ל ומניחים על קרח תוך איזון הצינורות.
- צנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות 5,000 x גרם בצנטריפוגה מצוננת מראש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש כל גלולה ב-50 מ"ל של ddH2O מקורר מראש (0°C עד 4°C), וצנטריפוגה שוב עם אותן הגדרות כמו השלב הקודם. שמור את התאים על קרח ככל האפשר.
- חזור על שלב 1.6.
- להשהות כל גלולה ב 25 מ"ל של ddH2O: 0.5 M סוכרוז, 10% גליצרול. צנטריפוגה ב-5,000 x גרם ב-4°C למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והחזירו את התאים לקרח.
- להשעות מחדש את כל הכדורים באותו 2 מ"ל של ddH2O: 0.5 M סוכרוז, 10% גליצרול.
- Aliquot לתוך 50 μL עד 100 μL מנות בצינורות microcentrifuge מצוננים מראש; יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.
2. אלקטרופורציה של L. reuteri
הערה: הימנע ככל האפשר pipetting בשלבים הבאים. מומלץ לכלול אלקטרופורציה מבוקרת, ללא תוספת פלסמיד, כדי להבטיח שבחירת האנטיביוטיקה מספקת.
- קח אלקטרוכשיר שלם L. reuteri aliquot והפשיר אותו על קרח.
- מערבבים בעדינות 5 μL עד 10 μL של פלסמיד (ריכוז פלסמיד סופי >6 ננומטר) לתוך aliquot מופשר, הימנעות pipetting ככל האפשר.
- מעבירים לקובט אלקטרופורציה מקורר קרח ברווח של 1 מ"מ.
- אלקטרופורטאט ב-1.25 kV, 400 Ω ו-25 μF.
- מוסיפים 1 מ"ל של מרק MRS בטמפרטורת החדר (RT) ומערבבים על ידי היפוך הקובט פעם או פעמיים.
- הכניסו את הקוביות לאינקובטור סטטי בטמפרטורה של 37°C למשך 2.5-3 שעות כדי לאפשר התאוששות.
- לוחים את כל הכמות על מספר צלחות אגר MRS עם בחירה מתאימה.
- הניחו את הצלחות בתוך מיכל אטום לחלוטין עם נר דולק קטן ("אור תה") ושקית אנאירובית היוצרת אווירה.
- גדל ב 37 ° C במשך 2-3 ימים או עד מושבות גלויות נוכחים.
3. מדידת חלבון הכתב הפלואורסצנטי העמיד לחומצה, mCherry2
- בחר את כל המושבות הדרושות למדידה וחסן לתוך microplate אחסון 96 בארות עם 1.5 מ"ל של מסנן מעוקר (לא autoclaved) מרק MRS לכל באר ואנטיביוטיקה בחירה מתאימה.
- יש לדגור באופן אירובי במשך 24 שעות לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד.
הערה: יש לשמור מיקרו-צלחת אחסון זו לשימוש בסעיף 4 (מושבה PCR). - L. reuteri יזרז החוצה מהתקשורת כאשר בשלב נייח; להשעות מחדש את תרבות הלילה באמצעות פיפטינג.
- העבירו 200 μL לצלחת שטוחה, בעלת תחתית שקופה, בעלת 96 בארות, העבירו את הצלחת לקורא לוחות, ומדדו את ה-OD והפלואורסצנטיות של mCherry2 (עירור [לדוגמה]: 589 ננומטר; פליטה [Em]: 610 ננומטר) או כתבים רלוונטיים אחרים.
4. אישור ספיגת פלסמיד באמצעות PCR מושבה
- מתוך microplate אחסון 96 באר מקטע 3, להעביר 5 μL לצינור PCR.
הערה: אם חלפו >5 דקות, ייתכן שיהיה צורך להשעות מחדש את L. reuteri פעם נוספת. - במיקרו-צנטריפוגה ניידת, סובבו כלפי מטה עד שניתן לראות את הגלולה (בערך 2 דקות ב-2,000 x גרם), השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-20 מיקרוליטר של 20 מילימטר NaOH.
- מרתיחים בחום של 95°C למשך 5 דקות, מערבולת, וחוזרים על הרתיחה פעם נוספת.
- מיד לצנן את הדגימות; נסו לשמור את הדגימות על קרח ככל האפשר בשלבים הבאים כדי להפחית את הסבירות לפירוק תבנית ועיכוב PCR.
- יש לסובב מטה במיקרו-צנטריפוגה ניידת במהירות של 2,000 x גרם למשך 2 דקות עד שפסולת התא נפלטת, ואז לקחת 1 μL של הסופרנאטנט ולמהול ל-99 μL של ddH2O נטול DNase ו-RNase קר כקרח (דילול של 100x).
- השתמש בדילול 100x כתבנית DNA בתגובת PCR סטנדרטית באמצעות פריימרים ספציפיים לפלסמיד. כלול בקרה חיובית עם פלסמיד נגזר E. coli מיני הכנה.
- מחזירים את הדגימות על קרח ומוסיפים צבע העמסה מתאים בריכוז 1x.
- יש להפעיל בג'ל אגרוז 1% במאגר TAE (חומצה טריס-אצטט-אתילאנדיאמיןטטראצטית [EDTA]) במתח של 110 וולט למשך 30 דקות. תמונה במידת הצורך.
5. פרוטוקול מיני הכנה עבור L. reuteri , ואחריו PCR כדי לאשר נוכחות פלסמיד
הערה: פרוטוקול המיועד לשימוש עם ערכת ההכנה הקטנה המפורטת בטבלת החומרים.
- יש לחסן את L. reuteri ב-10 מ"ל של מרק MRS המכיל אנטיביוטיקה מתאימה ולדגור במשך הלילה באופן אירובי בטמפרטורה של 37°C באינקובטור סטטי.
- צנטריפוגה בטמפרטורה של 5,000 x גרם למשך 10 דקות בצנטריפוגה מצוננת מראש של 4°C.
- יש לשטוף את הגלולה ב-2 מ"ל של חיץ P1 סטנדרטי (המצורף לערכה) על מנת לשלול חומציות שעלולה להפריע לשלבים מאוחרים יותר, צנטריפוגה עם אותה הגדרה שתוארה קודם לכן, ולהשליך את הסופרנטנט.
- יש להשהות מחדש את הגלולה ב-250 μL של חיץ P1 שונה המכיל 10 מ"ג/מ"ל ליזוזים ו-100 U/mL מוטנוליזין על מנת ליזה תאי חיידקים. לדגור במשך 1-2 שעות ב 37 ° C.
- הוסיפו 250 μL של חיץ P2, ערבבו על ידי היפוך ארבע עד שש פעמים, ודגרו ב-RT לא יותר מ-5 דקות.
- הוסף 350 μL של חיץ N3 (כלול בערכה) ומיד להפוך ארבע עד שש פעמים בעדינות כדי לערבב.
- צנטריפוגה ברזולוציה של 10,000 x גרם למשך 10 דקות.
- מעבירים כמה שיותר סופרנאטנט לעמוד ספין וצנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם למשך 60 שניות. השליכו את הזרימה.
- שטפו את עמוד הסחיטה עם 500 מיקרוליטר של PB חיץ (כלול בערכה) וצנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 60 שניות. השליכו את הזרימה.
- שטפו את עמוד הסחיטה עם 750 מיקרוליטר של PE חיץ (כלול בערכה), וצנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 60 שניות. השליכו את הזרימה והצנטריפוגה למשך 60 שניות כדי להסיר כל חיץ שיורי.
- מקם את עמוד הסחרור בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. יש למרוח 20-30 μL של ddH 2 O נטול DNAse ו-RNAse על המסנן של עמוד הספין ולהשאיר למשך1-2דקות, לפני צנטריפוגה של 10,000 x גרם למשך 60 שניות.
- בצע תגובת PCR סטנדרטית באמצעות פריימרים ספציפיים לפלסמיד (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGACA), כאשר אלואט מספק את ה- DNA של התבנית. כלול בקרה חיובית עם פלסמיד נגזר E. coli מיני הכנה.
הערה: הגדרות ה-PCR המשמשות במחקר זה הן: 98°C למשך 5 דקות, (98°C למשך 30 שניות, 55°C למשך 30 שניות, 72°C למשך 45 שניות) 30 מחזורים, 72°C למשך 2 דקות, החזקה של 4°C. הפרמטרים תלויים מאוד בפולימראז בו נעשה שימוש, באורך המקטע ובפריימרים המדויקים המשמשים כל אדם המשתמש בפרוטוקול זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יעילות טרנספורמציה
L. reuteri אינו דורש פלסמיד dcm-/dam- ללא מתילציה, כפי שנצפה עבור לקטובצילאיםאחרים 19,20 (ראה איור 1). אלקטרופורציה של L. reuteri DSM20016 עם 10 μL של pTRKH3_mCherry2 פלסמיד 8.5 kb (pAMβ1 theta origin of replication) אמורה לתת יעילות טרנספורמציה של בערך 80 יחידות יוצרות מושבה (CFU)/μg (חמש עד שמונה מושבות לכל 200 μL מצופה), ללא קשר למצב מתילציה פלסמיד. עם ריפוי סלקטיבי וטרנספורמציה מחדש, ניתן לקבל זני L. reuteri מוטנטים עם יעילות טרנספורמציה גדולה בהרבה21, שנצפו עם pTRKH3_mCherry2 של בערך 4 x 103 CFU/μg (200-250 מושבות לכל 200 μL מצופה), מה שמאפשר יישומים בעלי תפוקה גבוהה יותר. תוצאות דומות נצפו גם עבור הכתב mTFP1. טרנספורמציות בוצעו גם עם pNZ123 (pSH71 מעגל מתגלגל מקור), ללא חלבון כתב מכונן אקסוגני, וכתוצאה מכך יעילות טרנספורמציה של 3 x 104 CFU/μg DNA (איור משלים 1).
איור 1: יעילות אלקטרופורציה. סה"כ 10 ננומטר pTRKH3_mTFP1 ו 80 ננומטר pTRKH3_mCherry2 מלאי פלסמיד התקבלו משני מקורות: DH10β E. coli ו dcm-/dam- methylase knockout E. coli. לאחר מכן התחשמל L. reuteri עם 10 μL של שני פלסמידים שונים של תבנית מתילציה והמושבות נספרו. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תנאי צמיחה טרנספורמטיביים
L. reuteri הוא עמיד לאוויר, וניתן לגדלו בציר ועל אגר בתנאים אטמוספריים רגילים. עם זאת, הצלחת טרנספורמציה מסתמכת במידה רבה על יצירת סביבת צמיחה אנאירובית כאשר היא מצופה; זהו אולי התנאי החשוב ביותר להצלחת טרנספורמציה. O2 דליפות ניתן לזהות על ידי כולל צלחת של L. reuteri שלא עבר טרנספורמציה. המורפולוגיה של המושבה משתנה באופן ניכר בנוכחות חמצן (ראו איור 2); לחלופין, ניתן להשתמש באינדיקטורים אנאירוביים (ראה טבלת חומרים).
איור 2: מורפולוגיה של מושבת L. reuteri. מושבות השתנו עם פלסמיד pTRKH3_mCherry2. (A) בתנאי O2 נמוכים, המושבות נראות לבנות, אטומות, חלקות, עגולות, קמורות ומבריקות. (B) בתנאי O2 חלקיים או דולפים, המושבות נראות לבנות, אטומות, לא מועלות (גליות), עגולות, אומבונט (מעוגלות/ידיות) ומבריקות. (C) מושבות L. reuteri ללא טרנספורמציית פלסמיד תחת רמות O2 אטמוספריות. המושבות נראות אטומות או שקופות ואומבונט או שטוחות; הם תמיד נראים לובטים, עגולים ויבשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
מדידת חלבון כתב
ביטוי וגדילה של חלבונים מסוג Wild מסוג L. reuteri DSM20016 משתנים בין מושבות (ראו איור 3A), מה שמקשה על הסקת מסקנות מדויקות על פעילות המערכת. ניתן לבחור ולרפא כראוי סוג בר L. reuteri DSM20016; טרנספורמציה מחדש עשויה ליצור זנים עם מוטציות המאפשרות יעילות טרנספורמציה גדולה יותר. זן אחד שפותח בשיטה זו נראה יציב הרבה יותר במונחים של ביטוי חלבון מדווח (ראו איור 3B). מומלץ לחפש מוטציות כאלה, באמצעות ריפוי פלסמיד וטרנספורמציה מחדש, לפני ביצוע עבודה הדורשת ביטוי חלבון מכוונן.
איור 3: צמיחה, פלואורסצנטיות של כתבים ותוצאות PCR עבור L. reuteri שעבר טרנספורמציה. שני הניסויים משתמשים בפלסמיד pTRKH3_mCherry2 ב 80 ננומטר. (א,ב) כל עמודה בכל אחת משלוש חלקות המשנה מתייחסת לערך OD של אותה מושבה, ערך פלואורסצנטי (לדוגמה: 589 ננומטר; Em: 610 ננומטר), ותוצאת PCR (בלוק מוצק מציין פס נכון שנצפה). (A) כל המושבות מ L. reuteri DSM20016 טרנספורמציה נבחר (טרנספורמציית שליטה = אפס מושבות). מושבות מודגרות במרק MRS מסונן במשך 24 שעות לפני המדידה ברווח 100. (B) סך של 88 מושבות שנבחרו מזן L. reuteri DSM20016 שנבחרו ליעילות טרנספורמציה גבוהה יותר, ייצור חלבון עקבי יותר למדווח ועיכוב PCR נמוך יותר (טרנספורמציית בקרה = אפס מושבות). מושבות מודגרות במרק MRS מסונן במשך 24 שעות לפני המדידה ברווח 200. הפקדים הם בכחול, C = בקרת תא DSM20016 ללא טרנספורמציה, M = מרק MRS מסונן רק בקרת מדיה, וקווי שגיאה מציינים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
PCR מושבה
אין להשתמש ב-PCR כמושבה כאמצעי היחיד להסקת טרנספורמציה נכונה, מכיוון שהם יכולים להיות לא אמינים אפילו כאשר הדגימות מדוללות ונשמרות מקוררות (ראו איור 4). אם הבקרה ללא פלסמיד הכלולה בטרנספורמציות מציגה אפס מושבות, זה מרמז שלכל המושבות יש את הפלסמיד הנושא עמידות לאנטיביוטיקה. עם זאת, אם נדרש PCR מושבה, התנאים האופטימליים שנקבעו כאן יכולים להגדיל מאוד את ההצלחה.
איור 4: PCR מושבה של L. reuteri שעבר טרנספורמציה. (A) L . reuteri DSM20016 מושבות נבדקו לאיתור רצועות PCR חיוביות; שישה מהם הושגו וחוסנו למרק MRS טרי. דגימות של 5 μL שנלקחו בנקודות זמן שונות לאחר החיסון היו כפופות שוב ל- PCR ברמות הדילול שצוינו. הצבעים בכל תיבת זמן/דילול מעידים על הצלחת התאוששות ה-PCR: ירוק = פס נכון שנצפה; אדום = לא נצפתה להקה. (B) תוצאות עבור דילול קבוע של 100x מראות כי שינוי טמפרטורת ההכנה הביא לשיעורים שונים של הצלחת PCR: הדגימות הוכנו על קרח ו-PCR-ed באופן מיידי (89.77%), הוכנו בטמפרטורת החדר ו-PCR-ed מיד (75%), או הוכנו ב-RT ואז הודגרו ב-37°C במשך 30 דקות לפני PCR (27.27%). (C) (1) שמונה דגימות דילול חיוביות של 100x (R1-8) ממצב RT. (2) לאחר שהושארו ב-RT במשך 48 שעות, הדגימות עברו PCR-ed בפעם השנייה, והראו היעדר של הפסים ב~1.1 קילו-בתים; בקרות חיוביות ושליליות (נתיבים +/-) הם הנתיבים הימניים ביותר ב-C (2). הסולם ששימש היה 1 קילובייט בתוספת סולם הדנ"א, המופיע בטבלת החומרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
L. reuteri מיני הכנה
מיני הכנה עבור L. reuteri מוגבלת ומיועדת רק כשיטת אישור טרנספורמציה פלסמיד חלופית. פרסום קודם ציין כי זנים מסוימים הם lysed יעיל יותר על ידי mutanolysin22; פעולה כפולה של ליזוזים-מוטנוליזין נמצאה כיעילה ביותר עבור L. reuteri DSM20016. הפעלת המיני-פרפ דרך ג'ל אגרוז גורמת למריחה ולא לרצועות נצפות. עם זאת, PCR עוקב אמור לייצר את גדלי הפסים הצפויים (ראה איור 5).
איור 5: אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של מוצרי PCR ומיני-הכנה. אותן שש מושבות מאיור 4A הוכנו במיני-הכנה באמצעות הפרוטוקול שנקבע במאמר זה. (שורה תחתונה) מיני הכנה eluate מראה מריחה. (שורה עליונה) לאחר ביצוע PCR באמצעות eluant כתבנית DNA, רצועות חיוביות ברורות נצפים. הסולם ששימש היה 1 קילובייט בתוספת סולם הדנ"א, המופיע בטבלת החומרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: יעילות הטרנספורמציה של L. reuteri DSM20016 עם פלסמיד pNZ123. טרנספורמציות שבוצעו עם pNZ123 (pSH71 מעגל מתגלגל מקור), ללא חלבון כתב מכונן אקסוגני. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 1: קבצי CAD לתאים אנאירוביים. גיליון 1: שרטוט בסיס; גיליון 2: ציור קיר ארוך; גיליון 3: ציור קיר קטן; גיליון 4: ציור עליון; גיליון 5: ציור מכסה; גיליון 6: נעילת ציור שפתיים; גיליון 7: ציור מוט מהדק; גיליון 8: ציור צלחת מהדק; גיליון 9: סקירה כללית של האסיפה; גיליון 10: סקירה כללית עם חלקים ממוספרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלב הקריטי ביותר לשינוי של L. reuteri DSM20016 הוא יצירת תנאי צמיחה אנאירוביים לאחר טרנספורמציות מצופות; מושבות שנרכשות בתנאים אירוביים הן רק מזדמנות מאוד ובדרך כלל אינן מצליחות לגדול כאשר מחוסנים במרק MRS. יש לתרגל גם ציפוי של כל נפח ההתאוששות כדי למקסם את ההסתברות לצמיחת מושבה. אפילו עם שני השלבים הקריטיים האלה, יעילות הטרנספורמציה עדיין מהווה מגבלה על ניסויים, מאחר שמספר המושבות הצפויות יכול להגיע ל-1 או 2 לכל צלחת במהלך טרנספורמציות (ראו איור 1).
מיכלי מזון מסחריים שימשו בתחילה ונמצאו בלתי מספיקים להרחקה עקבית של O2. קבצי CAD לתאים אנאירוביים שתוכננו על ידי חנות המכונות של האוניברסיטה ניתן למצוא בקובץ משלים 1. מכיוון שקופסאות אלה יכולות לעיתים לחדור אוויר דרך רווחים קטנים בנגרות, מומלץ למלא אותן במים (לא אטומים) כדי לבדוק אם יש נזילות לפני השימוש הראשון; בדיקות עוקבות אינן נחוצות בדרך כלל. קופסאות אלה צריכות לכלול מערכות החלפה O 2 ולא מערכות בידוד O2, מכיוון שהן לא נבדקו להפעלת לחץ.
בעיות מדיה יכולות להתעורר; מרק MRS אוטוקלאבד הוא סלקטיבי אך בעל תכונות פלואורסצנטיות אוטומטיות מאוד, המעכבות את המדידה של קריאות פלואורסצנטיות נמוכות. שינוי לשימוש במרק MRS מעוקר מסנן משפר בעיה זו, אך הוא פחות סלקטיבי. L. reuteri מוריד את רמת החומציות של המדיה לסביבות pH 4 לאחר 24 שעות (ראה איור 6), כך שהמדיה דורשת חציצה כדי לזהות GFP23 רגיש לחומצה. שינינו פרוטוקול זה כדי להשתמש ב- mCherry2 עמיד יותר לחומצה2 במקום זאת, ובכך נמנעה בעיה זו.
איור 6: pH לאורך זמן של L. reuteri במרק MRS. L. reuteri DSM20016 מוריד pH לאורך זמן (קו מקווקו); ערך ה- pKa מציין את ה- pH שבו פלואורסצנטיות חלבון המדווח תהיה 50% מהערך המרבי עקב חומציות (קווים אופקיים). EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4.3, mCherry2 pKa = 3.3. יעילותו של כל חלבון מדווח מופחתת ל-50% מהפלואורסצנטיות המקסימלית בנקודות זמן שונות בשל רגישויותיהם לחומצה, כאשר הוא מיוצר בתוך L. reuteri חומצי יותר ויותר (קווים אנכיים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
L. reuteri נראה כי DSM20016 מעכב את מאמצי ה-PCR של המושבה, ומגביל מאוד את התועלת של הליך זה. 30 דקות בלבד ב-37°C לאחר שלב 4.3 יכולות להגדיל את שיעור כשל ה-PCR, בעוד ש-48 שעות ב-RT גורמות לכשל PCR מלא (ראו איור 4B,C). השינוי לדלל את הדגימות ולשמור את הדגימות על הקרח בכל עת הוא קריטי להגדלת הצלחת PCR המושבה.
הרבה עדיין לא ידוע על הפונקציות הפנימיות של L. reuteri DSM20016. לוחות בקרת טרנספורמציה ללא פלסמיד נוסף במהלך אלקטרופורציה, המראים אפס מושבות, צריכים לרמוז כי כל מושבות הקיימות במצב פלסמיד יש פלסמיד. עם זאת, PCR מושבה לאחר מכן הוכח לא לאשר באופן אמין ספיגת פלסמיד אפילו עם שינויים. זה יכול להיות בגלל הגבלת אנדונוקלאזות המשפילות מקטעי DNA PCR. אנדונוקלאז נתקלו במינים אחרים של Lactobacillaceae והתגברו באמצעות שימוש בסכר-/dcm-E.coli 19,20. L. reuteri DSM20016 יש מספר אנזימים משוערים לשינוי הגבלה המתוארים באמצעות ניתוח חישובי24. יעילות הטרנספורמציה של DSM20016 עשויה לעלות עוד יותר אם ניתן יהיה לאפיין ולהימנע מאתרי זיהוי האנזימים לשינוי הגבלה (RM) שלה. יש צורך בחקירה נוספת.
שיטת האלקטרופורציה המתוקנת המוצגת במאמר זה מציעה חלופה פחות מורכבת ויותר מודרנית לשיטה שתוארה בעבר עבור L. reuteri DSM20016 על ידי Ahrne et al.25. מאמר זה בוחן התניות משמעותיות שנעשו על ידי Ahrne et al. בנוגע לדרישות מתילציה של סכר/DCM לספיגת פלסמיד, אשר לא אומתו. שיטת הטרנספורמציה המפורטת במאמר זה מדגישה גם את דרישת הצמיחה האנאירובית הקריטית לאחר הציפוי, שלא הועברה במפורש על ידי Ahrne et al.
ניתן להשתמש בכמה שיטות וגישות המפורטות כאן ביישומים עתידיים כדי לסייע לניסיונות מניפולציה אחרים ממשפחת Lactobacillaceae , בעיקר: הכללת לוחות בקרת טרנספורמציה, שימוש בכתב mCherry2 עמיד לחומצה, דרישות טמפרטורת PCR של מושבה והכללת מוטנוליסין מיני הכנה. עם זאת, חלקם עשויים עדיין להזדקק לשינויים כדי לעבוד בצורה אופטימלית בזנים אחרים.
L. reuteri DSM20016 הוא בעל חשיבות קלינית וחקלאית בשל מיקומו לא רק כקומנסל גנרי של בעלי חוליות (עם שימושים פוטנציאליים כתוסף במזון לבעלי חיים), אלא גם כאחד ממספר קטן מאוד של זנים ממשפחת לקטובצילסיים הקשורים באופן מהותי לסביבת המעי האנושית8. מניפולציה יעילה של חיידק זה תפתח אותו כמארז לאספקה עתידית של טיפולים חדשניים במערכת העיכול וניטור לא פולשני של מצבים דלקתיים. במאמר זה, שיטות אלה נאספו במפורש והודגמו באופן קולקטיבי עם שינויים עבור, במיוחד, זן L. reuteri שאינו מודל DSM20016.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מעריכים מאוד את עצתו רבת הערך של פרופ' J.P. van Pijkeren (אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון), שהדרכתו בעבודה עם L. reuteri ATCC PTA 6475 סיפקה בסיס לשיטות המתוארות כאן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
References
- Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
- Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
- Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
- Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
- Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
- Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
- Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
- Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
- Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F.
- Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
- Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
- Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
- MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
- Oh, J. H., van Pijkeren, J. P.
- Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
- Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
- Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
- Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
- Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M.
- Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
- Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
- O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
- Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, Database issue D298-D299 (2015).
- Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).
