Fabrication de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique sur un processeur cellulaire automatisé

Summary

Cet article détaille le processus de fabrication des lymphocytes T à récepteurs antigéniques chimériques à usage clinique, en particulier à l’aide d’un processeur cellulaire automatisé capable d’effectuer la transduction virale et la culture de lymphocytes T. Nous formulons des recommandations et décrivons les pièges à éviter qui doivent être pris en compte lors de l’élaboration du processus et de la mise en œuvre d’un essai clinique de phase précoce.

Abstract

Les cellules T à récepteurs antigéniques chimériques (CAR)-T représentent une approche immunothérapeutique prometteuse pour le traitement de diverses maladies malignes et non malignes. Les cellules CAR-T sont des cellules T génétiquement modifiées qui expriment une protéine chimérique qui reconnaît et se lie à une cible de surface cellulaire, entraînant la destruction de la cellule cible. Les méthodes traditionnelles de fabrication des cellules CAR-T sont à forte intensité de main-d’œuvre, coûteuses et peuvent comporter un risque de contamination. Le CliniMACS Prodigy, un processeur cellulaire automatisé, permet de fabriquer des produits de thérapie cellulaire à l’échelle clinique dans un système fermé, minimisant ainsi le risque de contamination. Le traitement s’effectue de manière semi-automatique sous le contrôle d’un ordinateur et minimise ainsi l’implication humaine dans le processus, ce qui permet de gagner du temps et de réduire la variabilité et les erreurs.

Ce manuscrit et cette vidéo décrivent le processus de transduction des cellules T (TCT) pour la fabrication de cellules CAR-T à l’aide de ce processeur. Le processus TCT implique l’enrichissement des lymphocytes T CD4+/CD8+, l’activation, la transduction avec un vecteur viral, l’expansion et la récolte. À l’aide de la matrice d’activité, une fonctionnalité qui permet d’ordonner et de chronométrer ces étapes, le processus TCT peut être largement personnalisé. Nous fournissons une présentation de la fabrication des cellules CAR-T conformément aux bonnes pratiques de fabrication (BPF) actuelles et discutons des tests de libération requis et des expériences précliniques qui soutiendront une demande de nouveau médicament expérimental (IND). Nous démontrons la faisabilité et discutons des avantages et des inconvénients de l’utilisation d’un processus semi-automatique pour la fabrication clinique de cellules CAR-T. Enfin, nous décrivons un essai clinique en cours initié par un chercheur qui cible les tumeurs malignes à cellules B pédiatriques [NCT05480449] comme un exemple de la façon dont ce processus de fabrication peut être appliqué dans un cadre clinique.

Introduction

Le transfert adoptif de lymphocytes T modifiés pour exprimer un récepteur antigénique chimérique (CAR) a montré une efficacité remarquable dans le traitement des patients atteints de tumeurs malignes à cellules B réfractaires 1,2,3,4,5. Cependant, les méthodes traditionnelles de fabrication des cellules CAR-T sont à forte intensité de main-d’œuvre, prennent beaucoup de temps et nécessitent des techniciens hautement qualifiés pour effectuer des étapes hautement spécialisées. Par exemple, le processus de fabrication traditionnel d’un produit cellulaire CAR-T autologue implique la centrifugation par gradient de densité, l’élutriation ou la séparation magnétique pour enrichir les lymphocytes T, l’activation et la transduction avec un vecteur viral dans un flacon stérile, et l’expansion dans un bioréacteur avant la récolte et la formulation. Divers systèmes ont vu le jour récemment dans le but d’automatiser partiellement ce processus. Par exemple, le Miltenyi CliniMACS Prodigy (ci-après dénommé le « processeur ») est un dispositif de traitement cellulaire automatisé qui peut effectuer un grand nombre de ces étapes de manière automatisée 6,7,8,9. Une discussion approfondie des méthodes de fabrication CAR-T traditionnelles et automatisées est présentée dans un récent article de synthèse¹⁰.

Le processeur s’appuie sur les fonctionnalités du CliniMACS Plus, un dispositif médical approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour le traitement des cellules progénitrices hématopoïétiques. Le processeur comprend une unité de culture cellulaire qui permet le lavage, le fractionnement et la culture automatisés des cellules (Figure 1). Le processus de transduction des cellules T (TCT) est un programme prédéfini dans le dispositif du processeur qui reproduit en grande partie la fabrication manuelle des cellules CAR-T. TCT permet un traitement personnalisable des cellules à l’aide d’une interface utilisateur graphique (la « matrice d’activité », Figure 2). Étant donné que le processeur automatise de nombreuses étapes et consolide les fonctionnalités de plusieurs appareils en une seule machine, il nécessite moins de formation et de compétences de dépannage spécialisées de la part des technologues. Étant donné que toutes les étapes sont effectuées à l’intérieur d’un ensemble de tubes fermés à usage unique, le processeur peut être utilisé dans des installations dotées d’une infrastructure de traitement de l’air moins stricte que celle qui serait considérée comme acceptable pour un processus de fabrication ouvert. Par exemple, nous exploitons le transformateur dans une installation certifiée ISO classe 8 (comparable à la classe C de l’UE).

Figure 1 : Fabrication de cellules CAR-T à l’aide du système de transduction des cellules T. L’illustration montre le processeur avec le jeu de tubes installé. L’ensemble de tubes permet de connecter d’autres composants tels que des sacs contenant un tampon de traitement, un milieu de culture et un vecteur lentiviral par soudage stérile. Une fois que le produit de leucaphérèse est ajouté au sac d’application, il peut être étiqueté avec des billes de sélection de lymphocytes T, passé à travers la colonne de séparation, puis transféré dans le sac de réapplication. Les cellules sélectionnées sont ensuite dirigées vers l’unité de culture de l’instrument pour la culture et activées avec le réactif d’activation (voir le tableau des matériaux). Le produit final est collecté dans le sac de cellules cibles. Tout au long du processus, il est possible de prélever des échantillons pour le contrôle de la qualité de manière aseptique. Les chiffres gris à l’intérieur des cercles représentent les vannes numérotées du processeur qui dirigent le chemin du liquide à travers le jeu de tubes. Reproduit avec la permission de ¹¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Matrice d’activité. Après la sélection et l’activation des cellules T, le reste du processus de fabrication des cellules CAR-T est entièrement personnalisable. Les activités peuvent être ajoutées ou supprimées et programmées pour le jour et l’heure appropriés, et le volume de culture après l’activité peut être spécifié (Volume). Par exemple, l’activité de transduction a été configurée pour commencer à 10h00 le jour 1 et le volume de culture à la fin de l’activité a été défini sur 100 ml. La matrice d’activité peut être modifiée tout au long de la période de culture. L’état du processus peut être surveillé sur l’écran intégré de l’appareil de traitement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’objectif de ce manuscrit est de fournir un aperçu détaillé de la fabrication des cellules CAR-T à l’aide du processeur et de fournir des conseils sur les tests en cours de fabrication et de libération du produit qui seront probablement requis par les organismes de réglementation pour approuver une demande de nouveau médicament expérimental (IND). Le protocole présenté reste proche de l’approche recommandée par le fournisseur et constitue le protocole sous-jacent de l’IND 28617, qui est actuellement en cours d’évaluation dans le cadre d’un essai clinique de phase I/II initié par un investigateur monocentrique. Cet essai vise à déterminer l’innocuité et l’efficacité de l’utilisation de ce processeur pour fabriquer des cellules CAR-T autologues humanisées dirigées contre CD19 pour les patients atteints de leucémie aiguë lymphoblastique à cellules B (LAL B) ou de lymphome lymphoblastique de lignée B (B-LLY) [NCT05480449]. L’essai a débuté en septembre 2022 et devrait recruter jusqu’à 89 patients âgés de 0 à 29 ans atteints de B-ALL ou de B-Lly. Nous rapportons quelques résultats de fabrication de l’essai dans le manuscrit.

Nous tenons à souligner que, bien que le manuscrit soit présenté comme un protocole avec des étapes à suivre, il devrait être considéré comme un point de départ pour que d’autres commencent à optimiser leur propre processus de fabrication de cellules CAR-T. Une liste non exhaustive des variations possibles du protocole présenté comprend : l’utilisation de lymphocytes T frais au lieu de lymphocytes T cryoconservés comme matériau de départ ; l’utilisation d’une méthode différente d’enrichissement des lymphocytes T ou son omission totale ; l’utilisation de différents milieux et cocktails de cytokines tels que l’IL7/IL15 au lieu de l’IL2 ; faire varier la concentration de sérum AB humain ou l’omettre complètement ; le moment de la transduction ; l’utilisation de transductions « multi-hits » ; variation de l’agitation, des volumes de culture et du calendrier d’alimentation ; l’utilisation de différentes méthodes de transfert génétique, y compris l’électroporation d’acides nucléiques ou de vecteurs non lentiviraux ; l’utilisation d’un tampon de formulation finale et/ou d’un cryoprotecteur différent ; et l’infusion de cellules CAR-T fraîches au lieu d’être cryoconservées pour une perfusion ultérieure. Ces variations peuvent avoir un impact significatif sur la composition cellulaire et la puissance du produit thérapeutique.

Étape globale du processus	Journée du processus	Détails techniques
Enrichissement cellulaire	Jour 0	Sélection des lymphocytes T CD4+/CD8+
Activation cellulaire		Ensemencement et activation de la culture des lymphocytes T
Transduction cellulaire	Jour 1	Transduction lentivirale (volume de culture de 100 ml)
Expansion cellulaire (suivie de la formulation cellulaire)	Jour 2	—
	Jour 3	Lavage de culture (1 cycle) ; Agitateur activé ; Le volume de culture augmente jusqu’à 200 mL
	Jour 4	—
	Jour 5	Aliment (50 ml) ; Le volume de culture atteint le volume final de 250 mL
	Jour 6	Échantillon en cours de fabrication ; Échange de médias (-125 mL / +125 mL)
	Jour 7	Échange de milieux (-150 mL / +150 mL) ou Harvest
	Jour 8	Échantillon en cours de fabrication ; Échange de milieux (-150 mL / +150 mL) ou Harvest
	Jour 9	Échange de milieux (-180 mL / +180 mL) ou Harvest
	Jour 10	Échantillon en cours de fabrication ; Échange de milieux (-180 mL / +180 mL) ou Harvest
	Jour 11	Échange de milieux (-180 mL / +180 mL) ou Harvest
	Jour 12	Échange de milieux (-180 mL / +180 mL) ou Harvest
	Jour 13	Récolter

Tableau 1 : Chronologie et aperçu du processus. Ce tableau résume les étapes du processus TCT utilisées dans un essai clinique en cours [NCT05480449]. Le processus commence par l’enrichissement des lymphocytes T par la sélection des CD4+/CD8+, l’ensemencement de la culture et l’activation le jour 0, suivi de la transduction le jour 1. Les cellules se reposent pendant 48 h, suivies d’un lavage de culture, d’une augmentation du volume de culture à 200 ml et d’une agitation à l’aide d’un mécanisme d’agitation. Le jour 6, le premier échantillon en cours de fabrication est prélevé. Les cellules sont prélevées une fois qu’il y a suffisamment de cellules disponibles pour au moins trois doses complètes de cellules CAR-T (5 × 10 6 cellules CAR-T/kg si le patient pèse <50 kg, sinon 2,5 × 10⁸ cellules CAR-T) et des tests de contrôle de la qualité (~2 × 10⁶ cellules CAR-T) ; ou une fois que la culture atteint un total de 4-5 x 10⁹ cellules. Abréviations : TCT = transduction des lymphocytes T ; CAR-T = lymphocytes T récepteurs de l’antigène chimérique ; MACS = tri cellulaire activé par magnétisme.

Protocol

Toutes les recherches ont été effectuées conformément aux directives de l’établissement avec l’approbation de l’Institutional Review Board (IRB) de l’hôpital, et tous les sujets ont donné leur consentement éclairé à la publication des données recueillies dans le cadre de l’essai.REMARQUE : La première section du protocole donne un aperçu général du processus de fabrication des CAR-T. Les sections restantes fournissent les instructions étape par étape. Le protocole décrit le flux de travai…

Representative Results

Les résultats des trois premiers essais de fabrication de CAR-T de l’essai NCT05480449 sont présentés ci-dessous dans le tableau 3. Le matériel de départ, le vecteur, les cytokines de culture et les concentrations sériques AB ont été maintenus constants pour chaque essai. Les produits ont été récoltés le jour 7 ou 8. La croissance cellulaire quotidienne moyenne était de 46 % (augmentation du nombre total de cellules), ce qui indique que le processus TCT était efficace pour favoriser l’e…

Discussion

La thérapie cellulaire CAR-T est apparue comme une approche thérapeutique prometteuse pour les cellules B et d’autres tumeurs malignes. Cependant, les méthodes traditionnelles de fabrication des cellules CAR-T présentent plusieurs limites, telles qu’un coût élevé, une production à forte intensité de main-d’œuvre et des étapes ouvertes qui augmentent le risque de contamination. Récemment, plusieurs plates-formes semi-automatisées, dont Miltenyi CliniMACS Prodigy (le « processeur »), ont vu le jour pou…

Materials

12 x 75 borosilicate tubes	Charles River	TL1000
20 mL Reagent Bag	Miltenyi Biotec	170-076-631
50 mL Conical Tube	Fisher	05-539-10
150 mL Transfer Set	Fenwal	4R2001
2,000 mL Transfer Set	Fenwal	4R2041
7AAD	Fisher Scientific	BDB559925
Alcohol Prep	Tyco/Healthcare
Bag Access	Medline	2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-643
CD19 CAR Detection Reagent Biotin	Miltenyi Biotec	130-129-550
CD19 PE	BD	555413
CD3 APC	BD	340440
CD4 VioBright FITC REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-229
CD45 VioBlue REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-681
Cellometer Reference Beads 10um	Nexcelom	B10-02-020
Cellometer Reference Beads 15um	Nexcelom	B15-02-010
Cellometer Reference Beads 5um	Nexcelom	B05-02-050
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	276-01	The CD4 reagent
CliniMACS CD8 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	275-01	The CD8 reagent
CliniMACS PBS/EDTA Buffer	Miltenyi Biotec	130-021-201	The buffer
DMSO	Origen	CP-10
Freezing Bag 50 mL	Miltenyi Biotec	200-074-400
Freezing Vial, 1.8 mL	Nunc	12565171N
Freezing Vial, 4.5 mL	Nunc	12565161N
Human AB serum	Valley Biomedical		Sterile filtered, heat inactivated
Human Serum Albumin 25%	Grifols	68516-5216-1
Human Serum Albumin 5%	Grifols	68516-5214-1
MACS GMP Recombinant Human IL-2	Miltenyi Biotec	170-076-148	The cytokines
MACS GMP T Cell TransAct	Miltenyi Biotec	200-076-202	The activation reagent
MycoSeq Mycoplasma Detection Kit	Life Technologies	4460623
Needles, Hypodermic 14G	Medline	SWD200573
Needles, SlideSafe 18G	BD	B-D305918
Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492209
Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492225
Pipets 10 mL	Fisher	13-678-27F
Pipets 25 mL	Fisher	13-675-30
Pipets 5 mL	Fisher	13-678-27E
Plasmalyte-A	Baxter	2B2544X	The electrolyte solution
Prodigy TS520 Tubing Set	Miltenyi Biotec	170-076- 600	The tubing set
Sterile Field	Medline	NON21001
Streptavidin PE-Vio770	Miltenyi Biotec	130-106-793
Syringe 1 mL	BD	309628
Syringe 10 mL	BD	302995
Syringe 3 mL	BD	309657
Syringe 30 mL	BD	302832
Syringe 50 mL	BD	309653
TexMACS GMP Medium	Miltenyi Biotec	170-076-306	The medium
Triple Sampling Adapter	Miltenyi Biotec	170-076-609
Viral Vector	CHOP Clinical Vector Core		huCART19
Equipment
Biological Safety Cabinet	The Baker Co
Cellometer Auto 2000	Nexcelom
CliniMACS Prodigy	Miltenyi Biotec	200-075-301	The processor
Controlled Rate Freezer	Planer/Kryosave
Endosafe nexgen-PTS150K	Charles River
Mettler Balance	Mettler
Refrigerated Centrifuge	Thermo Fisher
Refrigerated Centrifuge	Fisher Sci
SCD Sterile Tubing Welder	Terumo
Sebra Tube Sealer	Sebra
Varitherm	Barkey		The dry thaw device
XN-330 Hematology Analyzer	Sysmex