Respirometrie met hoge resolutie om de mitochondriale functie in menselijke spermatozoa te beoordelen
Summary
De analyse van de mitochondriale functie van sperma door middel van respirometrie met hoge resolutie maakt het mogelijk om het zuurstofverbruik van vrij bewegende spermatozoa in een gesloten kamersysteem te meten. De techniek kan worden toegepast om de ademhaling in menselijke spermatozoa te meten, wat informatie geeft over de mitochondriale kenmerken en integriteit van sperma.
Abstract
De kwaliteit van het sperma wordt vaak bestudeerd door middel van routinematige sperma-analyse, die beschrijvend en vaak niet doorslaggevend is. Mannelijke onvruchtbaarheid wordt in verband gebracht met veranderde mitochondriale activiteit van het sperma, dus de meting van de mitochondriale functie van het sperma is een indicator van de kwaliteit van het sperma. Respirometrie met hoge resolutie is een methode om het zuurstofverbruik van cellen of weefsels in een gesloten kamersysteem te meten. Deze techniek kan worden toegepast om de ademhaling in menselijk sperma te meten en geeft informatie over de kwaliteit en integriteit van de mitochondriën van het sperma. Respirometrie met hoge resolutie zorgt ervoor dat de cellen vrij kunnen bewegen, wat a priori een voordeel is in het geval van sperma. Deze techniek kan worden toegepast met intacte of gepermeabiliseerde spermatozoa en maakt de studie mogelijk van de mitochondriale functie van intact sperma en de activiteit van individuele ademhalingsketencomplexen. Het oxygraafinstrument met hoge resolutie maakt gebruik van sensoren om de zuurstofconcentratie te meten in combinatie met gevoelige software om het zuurstofverbruik te berekenen. De gegevens worden gebruikt om ademhalingsindexen te berekenen op basis van de zuurstofverbruiksratio’s. Bijgevolg zijn de indices de verhoudingen van twee zuurstofverbruikssnelheden en worden ze intern genormaliseerd naar het celaantal of de eiwitmassa. De respiratoire indices zijn een indicator van de mitochondriale functie en disfunctie van het sperma.
Introduction
Mannelijke onvruchtbaarheid is naar schatting verantwoordelijk voor 40%-50% van alle gevallen van onvruchtbaarheid bijparen1. Conventionele sperma-analyse speelt een cruciale rol bij het bepalen van de mannelijke vruchtbaarheid; Ongeveer 15% van de onvruchtbare mannen heeft echter normale spermaparameters2. Bovendien geeft routinematige sperma-analyse beperkte informatie over de functie van het sperma en weerspiegelt het geen subtiele spermadefecten3.
Mitochondriën van sperma hebben een speciale structuur, omdat ze als een spiraalvormig omhulsel rond de flagella zijn gerangschikt. De mitochondriale schede bevat een variabel aantal mitochondriën die verbonden zijn door intermitochondriale linkers en verankerd zijn aan het cytoskelet door geordende eiwitarrangementen op het buitenste mitochondriale membraan 4,5. Deze structuur maakt het bijzonder moeilijk om de mitochondriën van sperma te isoleren. Daarom maken de meeste onderzoeken naar de mitochondriale functie van sperma gebruik van in situ-analyses of gedemembraneerd sperma6.
De mitochondriale structuur en functie van sperma zijn consequent in verband gebracht met mannelijke onvruchtbaarheid 7,8,9,10,11, wat suggereert dat analyse van de structuur en functie van deze organellen een goede kandidaat kan zijn voor opname in sperma-analyse.
Mitochondriën spelen een belangrijke rol in het cellulaire energiemetabolisme, met name door zuurstof te gebruiken om adenosinetrifosfaat (ATP) te produceren door middel van oxidatieve fosforylering (OXPHOS). Met name bij spermatozoa wordt de bron van ATP (glycolyse vs. OXPHOS) betwist, en veel van de gegevens blijven controversieel en zijn afhankelijk van verschillende experimentele benaderingen 4,12,13. Metingen van de ademhaling door middel van oximetrie bieden belangrijke inzichten in de mitochondriale ademhalingscapaciteit, de mitochondriale integriteit en het energiemetabolisme van de cel14,15,16. Traditioneel wordt deze techniek uitgevoerd met behulp van de Clark-zuurstofelektrode – een instrument dat al meer dan 50 jaar wordt gebruikt om mitochondriale ademhaling te meten17,18. Bovendien is het mitochondriale zuurstofverbruik van sperma geanalyseerd met behulp van de klassieke Clark-zuurstofelektrode 19,20,21. Respirometrie met hoge resolutie (HRR) met behulp van oxygrafen (Oroboros) biedt een hogere gevoeligheid dan het gebruik van klassieke respirometrie-apparaten22. De oxygrafen bestaan uit twee kamers met injectiepoorten en elke kamer heeft een polarografische zuurstofsensor. Met deze techniek is het mogelijk om weefselglaasjes, cellen en geïsoleerde mitochondriale suspensies te analyseren. Het monster wordt continu in de kamer geroerd en tijdens het experiment wordt het zuurstofverbruik gemeten en worden de zuurstofsnelheden berekend met behulp van specifieke software. De kamers vertonen een verminderde zuurstoflekkage, wat een voordeel is ten opzichte van de conventionele zuurstofelektrode-apparaten14,23.
Net als bij andere cellen is in het geval van spermatozoa de gevoeligheid van HRR-apparatuur hoger dan bij conventionele respirometrie, wat betekent dat HRR-apparatuur kan worden gebruikt voor de analyse van een beperkt aantal intacte of gepermeabiliseerde zaadcellen. Er zijn twee hoofdstrategieën voor het beoordelen van de mitochondriale functie van sperma door HRR: (a) het meten van het zuurstofverbruik in intacte cellen, waarbij de ademhalingsfunctie wordt gereproduceerd in een medium dat substraten zoals glucose bevat, of (b) het meten van het zuurstofverbruik in gepermeabiliseerde cellen met behulp van een van de OXPHOS-complexen, met de toevoeging van specifieke substraten om elke functie afzonderlijk te controleren.
In de huidige studie beschrijven we het gebruik van HRR om de mitochondriale ademhaling in menselijke zaadcellen te bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De HRR hangt in belangrijke mate af van verschillende stappen: (a) het onderhoud van de apparatuur, (b) nauwkeurige kalibratie van de zuurstofsensoren, (c) de titratie van de ontkoppelingseenheid26 en ten slotte (d) het adequate gebruik van indices die de mitochondriale functie vertegenwoordigen. Het onderhoud van de apparatuur is cruciaal. Het wordt aanbevolen om de membranen van de polarografische zuurstofsensor regelmatig te vervangen en de instrumentele achtergrond te corrigeren. Uitgebreid wa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de Fertilab Andrologiekliniek, in het bijzonder José María Montes en Andrea Torrents, bedanken voor het feit dat ze ons toegang hebben gegeven tot donoren. Financiering: A.C. wordt ondersteund door subsidies van Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Aanvullende financiering werd verkregen van het Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. en R.S. worden ondersteund door Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 en FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. wordt ondersteund door POS_FMV_2018_1_1007814 en CAP-UDELAR 2020. De figuren werden geïllustreerd aan de hand van Biorender.com.
Materials
| Acid free- Bovine serum albumine | Sigma Aldrich | A8806 | |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma Aldrich | A5285 | |
| Animycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | |
| DatLab sofware version 4,2 | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L malic acid | Sigma Aldrich | M1000 | |
| Magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Microliter Syringes | Hamilton | 87900 or 80400 | |
| Microscope camera | Basler | acA780-75gc | |
| Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ | Nikon | N/A | |
| Monopotassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254 | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Oxygraph-2 K | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Power O2k-Respirometer | Oroboros Intruments | 10033-01 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Sodium lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | |
| Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research | Microptic | N/A | |
| Sperm Counting Chamber DRM-600 | Millennium Sciences CELL-VU | N/A | |
| Succinate disodium salt | Sigma Aldrich | W327700 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).
- Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).
- Wang, C., Swerdloff, R. S. Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).
- Amaral, A. Energy metabolism in mammalian sperm motility. WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569 (2022).
- Leung, M. R., et al. In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118 (2021).
- Moraes, C. R., Meyers, S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).
- Cassina, A., et al. Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production. Biology of Reproduction. 93 (5), 119 (2015).
- Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).
- Amaral, A., Lourenço, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), e13666 (2021).
- Uribe, P., et al. Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa. Andrologia. 49 (9), e12753 (2017).
- Storey, B. T. Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe. The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).
- Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979 (2022).
- Gnaiger, E., Dykens, J. A., Will, Y. Chapter 12 – Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. , 325-352 (2008).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000 (2021).
- Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Stendardi, A., et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).
- Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency. International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).
- Ferramosca, A., et al. Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols. Antioxidants. 10 (2), 217 (2021).
- Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).
- . O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Available from: https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf (2020)
- WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2010)
- . O2k-protocols SOP: O2k quality control 1 Available from: https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf (2021)
- Gnaiger, E. . Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , (2012).
- Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).
- Holt, W. V., Van Look, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).
- Sousa, A. P., et al. Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PloS One. 6 (3), e18112 (2011).
- Moscatelli, N., et al. Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential. Scientific Reports. 7, 17931 (2017).
- Ferreira, J. J., et al. Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation. Redox Biology. 48, 102176 (2021).
- Irigoyen, P., et al. Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684 (2022).
