L’analisi della funzione mitocondriale degli spermatozoi mediante respirometria ad alta risoluzione consente di misurare il consumo di ossigeno degli spermatozoi che si muovono liberamente in un sistema a camera chiusa. La tecnica può essere applicata per misurare la respirazione negli spermatozoi umani, che fornisce informazioni sulle caratteristiche e sull’integrità mitocondriale degli spermatozoi.
La qualità dello sperma viene spesso studiata mediante lo spermiogramma di routine, che è descrittivo e spesso inconcludente. L’infertilità maschile è associata a un’alterata attività mitocondriale degli spermatozoi, quindi la misurazione della funzione mitocondriale degli spermatozoi è un indicatore della qualità dello sperma. La respirometria ad alta risoluzione è un metodo per misurare il consumo di ossigeno di cellule o tessuti in un sistema a camera chiusa. Questa tecnica può essere implementata per misurare la respirazione negli spermatozoi umani e fornisce informazioni sulla qualità e l’integrità dei mitocondri degli spermatozoi. La respirometria ad alta risoluzione consente alle cellule di muoversi liberamente, il che è un vantaggio a priori nel caso degli spermatozoi. Questa tecnica può essere applicata con spermatozoi intatti o permeabilizzati e consente di studiare la funzione mitocondriale degli spermatozoi intatti e l’attività dei singoli complessi della catena respiratoria. Lo strumento ossigrafo ad alta risoluzione utilizza sensori per misurare la concentrazione di ossigeno accoppiati a un software sensibile per calcolare il consumo di ossigeno. I dati vengono utilizzati per calcolare gli indici respiratori in base ai rapporti di consumo di ossigeno. Di conseguenza, gli indici sono le proporzioni di due tassi di consumo di ossigeno e sono normalizzati internamente al numero di cellule o alla massa proteica. Gli indici respiratori sono un indicatore della funzione mitocondriale e della disfunzione degli spermatozoi.
Si stima che l’infertilità maschile rappresenti il 40%-50% di tutti i casi di infertilità nelle coppie1. Lo spermiogramma convenzionale svolge un ruolo cruciale nel determinare la fertilità maschile; Tuttavia, circa il 15% degli uomini infertili ha parametri spermatici normali2. Inoltre, lo spermiogramma di routine fornisce informazioni limitate sulla funzione degli spermatozoi e non riflette i difetti sottili degli spermatozoi3.
I mitocondri degli spermatozoi hanno una struttura speciale, in quanto sono disposti come una guaina elicoidale attorno ai flagelli. La guaina mitocondriale contiene un numero variabile di mitocondri collegati da linker intermitocondriali e ancorati al citoscheletro da disposizioni proteiche ordinate sulla membrana mitocondriale esterna 4,5. Questa struttura rende particolarmente difficile l’isolamento dei mitocondri degli spermatozoi. Pertanto, la maggior parte degli studi sulla funzione mitocondriale degli spermatozoi utilizza analisi in situ o spermatozoi demembranati6.
La struttura e la funzione mitocondriale degli spermatozoi sono state costantemente collegate all’infertilità maschile 7,8,9,10,11, suggerendo che l’analisi della struttura e della funzione di questi organelli può essere un buon candidato per l’inclusione nell’analisi dello sperma.
I mitocondri svolgono un ruolo importante nel metabolismo energetico cellulare, in particolare utilizzando l’ossigeno per produrre adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Negli spermatozoi, in particolare, la fonte di ATP (glicolisi vs. OXPHOS) è controversa e molti dei dati rimangono controversi e dipendono da diversi approcci sperimentali 4,12,13. Le misurazioni della respirazione mediante ossimetria offrono informazioni significative sulla capacità respiratoria mitocondriale, sull’integrità mitocondriale e sul metabolismo energetico della cellula14,15,16. Tradizionalmente, questa tecnica è stata eseguita utilizzando l’elettrodo di ossigeno Clark, uno strumento che è stato utilizzato per misurare la respirazione mitocondriale per più di 50 anni17,18. Inoltre, il consumo di ossigeno mitocondriale degli spermatozoi è stato analizzato utilizzando il classico elettrodo di ossigeno Clark 19,20,21. La respirometria ad alta risoluzione (HRR) mediante ossigrafi (Oroboros) fornisce una sensibilità maggiore rispetto all’utilizzo di dispositivi di respirometria classici22. Gli ossigrafi sono composti da due camere con porte di iniezione e ogni camera ha un sensore di ossigeno polarografico. Con questa tecnica è possibile analizzare vetrini di tessuto, cellule e sospensioni mitocondriali isolate. Il campione viene continuamente agitato nella camera e, durante l’esperimento, viene misurato il consumo di ossigeno e i tassi di ossigeno vengono calcolati utilizzando un software specifico. Le camere mostrano una ridotta perdita di ossigeno, che è un vantaggio rispetto ai dispositivi convenzionali con elettrodi di ossigeno14,23.
Come per altre cellule, nel caso degli spermatozoi, la sensibilità dell’apparecchiatura HRR è superiore a quella della respirometria convenzionale, il che significa che l’apparecchiatura HRR può essere utilizzata per l’analisi di un numero limitato di spermatozoi intatti o permeabilizzati. Esistono due strategie principali per valutare la funzione mitocondriale degli spermatozoi mediante HRR: (a) misurare il consumo di ossigeno nelle cellule intatte, che comporta la riproduzione della funzione respiratoria in un mezzo contenente substrati come il glucosio, o (b) misurare il consumo di ossigeno nelle cellule permeabilizzate utilizzando uno dei complessi OXPHOS, con l’aggiunta di substrati specifici per monitorare ciascuna funzione separatamente.
Nel presente studio, descriviamo l’uso dell’HRR per determinare la respirazione mitocondriale negli spermatozoi umani.
L’HRR dipende in modo critico da diverse fasi: (a) la manutenzione dell’apparecchiatura, (b) la calibrazione accurata dei sensori di ossigeno, (c) la titolazione del disaccoppiatore26 e, infine, (d) l’uso adeguato degli indici che rappresentano la funzione mitocondriale. La manutenzione dell’attrezzatura è fondamentale. Si raccomanda di sostituire regolarmente le membrane del sensore polarografico di ossigeno e di correggere lo sfondo strumentale. Un lavaggio estensivo dopo il prelievo degli sper…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo la clinica di Andrologia Fertilab, in particolare José María Montes e Andrea Torrents, per averci permesso di accedere ai donatori. Finanziamento: A.C. è sostenuto da borse di studio dell’Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Ulteriori finanziamenti sono stati ottenuti dal Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. e R.S. sono sostenuti dall’Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 e FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. è supportato da POS_FMV_2018_1_1007814 e CAP-UDELAR 2020. Le figure sono state illustrate utilizzando Biorender.com.
Acid free- Bovine serum albumine | Sigma Aldrich | A8806 | |
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma Aldrich | A5285 | |
Animycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | |
DatLab sofware version 4,2 | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
D-glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
L glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
L malic acid | Sigma Aldrich | M1000 | |
Magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Microliter Syringes | Hamilton | 87900 or 80400 | |
Microscope camera | Basler | acA780-75gc | |
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ | Nikon | N/A | |
Monopotassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | |
MOPS | Sigma Aldrich | M1254 | |
Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
Oxygraph-2 K | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
Power O2k-Respirometer | Oroboros Intruments | 10033-01 | |
Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
Saccharose | Sigma Aldrich | S0389 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sodium lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | |
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research | Microptic | N/A | |
Sperm Counting Chamber DRM-600 | Millennium Sciences CELL-VU | N/A | |
Succinate disodium salt | Sigma Aldrich | W327700 |