Respirometria ad alta risoluzione per valutare la funzione mitocondriale negli spermatozoi umani

Summary

L’analisi della funzione mitocondriale degli spermatozoi mediante respirometria ad alta risoluzione consente di misurare il consumo di ossigeno degli spermatozoi che si muovono liberamente in un sistema a camera chiusa. La tecnica può essere applicata per misurare la respirazione negli spermatozoi umani, che fornisce informazioni sulle caratteristiche e sull’integrità mitocondriale degli spermatozoi.

Abstract

La qualità dello sperma viene spesso studiata mediante lo spermiogramma di routine, che è descrittivo e spesso inconcludente. L’infertilità maschile è associata a un’alterata attività mitocondriale degli spermatozoi, quindi la misurazione della funzione mitocondriale degli spermatozoi è un indicatore della qualità dello sperma. La respirometria ad alta risoluzione è un metodo per misurare il consumo di ossigeno di cellule o tessuti in un sistema a camera chiusa. Questa tecnica può essere implementata per misurare la respirazione negli spermatozoi umani e fornisce informazioni sulla qualità e l’integrità dei mitocondri degli spermatozoi. La respirometria ad alta risoluzione consente alle cellule di muoversi liberamente, il che è un vantaggio a priori nel caso degli spermatozoi. Questa tecnica può essere applicata con spermatozoi intatti o permeabilizzati e consente di studiare la funzione mitocondriale degli spermatozoi intatti e l’attività dei singoli complessi della catena respiratoria. Lo strumento ossigrafo ad alta risoluzione utilizza sensori per misurare la concentrazione di ossigeno accoppiati a un software sensibile per calcolare il consumo di ossigeno. I dati vengono utilizzati per calcolare gli indici respiratori in base ai rapporti di consumo di ossigeno. Di conseguenza, gli indici sono le proporzioni di due tassi di consumo di ossigeno e sono normalizzati internamente al numero di cellule o alla massa proteica. Gli indici respiratori sono un indicatore della funzione mitocondriale e della disfunzione degli spermatozoi.

Introduction

Si stima che l’infertilità maschile rappresenti il 40%-50% di tutti i casi di infertilità nelle coppie¹. Lo spermiogramma convenzionale svolge un ruolo cruciale nel determinare la fertilità maschile; Tuttavia, circa il 15% degli uomini infertili ha parametri spermatici normali². Inoltre, lo spermiogramma di routine fornisce informazioni limitate sulla funzione degli spermatozoi e non riflette i difetti sottili degli spermatozoi³.

I mitocondri degli spermatozoi hanno una struttura speciale, in quanto sono disposti come una guaina elicoidale attorno ai flagelli. La guaina mitocondriale contiene un numero variabile di mitocondri collegati da linker intermitocondriali e ancorati al citoscheletro da disposizioni proteiche ordinate sulla membrana mitocondriale esterna ^4,5. Questa struttura rende particolarmente difficile l’isolamento dei mitocondri degli spermatozoi. Pertanto, la maggior parte degli studi sulla funzione mitocondriale degli spermatozoi utilizza analisi in situ o spermatozoi demembranati⁶.

La struttura e la funzione mitocondriale degli spermatozoi sono state costantemente collegate all’infertilità maschile 7,8,9,10,11^, suggerendo che l’analisi della struttura e della funzione di questi organelli può essere un buon candidato per l’inclusione nell’analisi dello sperma.

I mitocondri svolgono un ruolo importante nel metabolismo energetico cellulare, in particolare utilizzando l’ossigeno per produrre adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Negli spermatozoi, in particolare, la fonte di ATP (glicolisi vs. OXPHOS) è controversa e molti dei dati rimangono controversi e dipendono da diversi approcci sperimentali 4,12,13. Le misurazioni della respirazione mediante ossimetria offrono informazioni significative sulla capacità respiratoria mitocondriale, sull’integrità mitocondriale e sul metabolismo energetico della cellula^14,15,16. Tradizionalmente, questa tecnica è stata eseguita utilizzando l’elettrodo di ossigeno Clark, uno strumento che è stato utilizzato per misurare la respirazione mitocondriale per più di 50 anni^17,18. Inoltre, il consumo di ossigeno mitocondriale degli spermatozoi è stato analizzato utilizzando il classico elettrodo di ossigeno Clark 19,20,21. La respirometria ad alta risoluzione (HRR) mediante ossigrafi (Oroboros) fornisce una sensibilità maggiore rispetto all’utilizzo di dispositivi di respirometria classici²². Gli ossigrafi sono composti da due camere con porte di iniezione e ogni camera ha un sensore di ossigeno polarografico. Con questa tecnica è possibile analizzare vetrini di tessuto, cellule e sospensioni mitocondriali isolate. Il campione viene continuamente agitato nella camera e, durante l’esperimento, viene misurato il consumo di ossigeno e i tassi di ossigeno vengono calcolati utilizzando un software specifico. Le camere mostrano una ridotta perdita di ossigeno, che è un vantaggio rispetto ai dispositivi convenzionali con elettrodi di ossigeno^14,23.

Come per altre cellule, nel caso degli spermatozoi, la sensibilità dell’apparecchiatura HRR è superiore a quella della respirometria convenzionale, il che significa che l’apparecchiatura HRR può essere utilizzata per l’analisi di un numero limitato di spermatozoi intatti o permeabilizzati. Esistono due strategie principali per valutare la funzione mitocondriale degli spermatozoi mediante HRR: (a) misurare il consumo di ossigeno nelle cellule intatte, che comporta la riproduzione della funzione respiratoria in un mezzo contenente substrati come il glucosio, o (b) misurare il consumo di ossigeno nelle cellule permeabilizzate utilizzando uno dei complessi OXPHOS, con l’aggiunta di substrati specifici per monitorare ciascuna funzione separatamente.

Nel presente studio, descriviamo l’uso dell’HRR per determinare la respirazione mitocondriale negli spermatozoi umani.

Protocol

Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Etico della Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. Figura 1: Flusso di lavoro per la respirometria ad alta risoluzione per valutare la funzione mitocondriale in spermatozoi umani intatti e permeabilizzati. Il protocollo è stato suddi…

Representative Results

Determinazione della concentrazione ottimale di digitonina negli spermatozoiIn questo protocollo, presentiamo l’uso dell’HRR per monitorare in tempo reale i cambiamenti in OXPHOS negli spermatozoi umani. Poiché il metodo può essere utilizzato per analizzare spermatozoi intatti o permeabilizzati alle digitonine, presentiamo innanzitutto la standardizzazione della concentrazione di digitonina necessaria per permeabilizzare gli spermatozoi (Figura 3). <p class="jove_c…

Discussion

L’HRR dipende in modo critico da diverse fasi: (a) la manutenzione dell’apparecchiatura, (b) la calibrazione accurata dei sensori di ossigeno, (c) la titolazione del disaccoppiatore²⁶ e, infine, (d) l’uso adeguato degli indici che rappresentano la funzione mitocondriale. La manutenzione dell’attrezzatura è fondamentale. Si raccomanda di sostituire regolarmente le membrane del sensore polarografico di ossigeno e di correggere lo sfondo strumentale. Un lavaggio estensivo dopo il prelievo degli sper…

Materials

Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700